第一部分UTP11通过核仁应激和铁死亡调节肿瘤生长研究背景和目的:癌症是全球的重大公共卫生问题,严重威胁人类健康,并且发病率和死亡率不断上升。目前大部分肿瘤的治疗方式仍然是传统的手术治疗、放射治疗和化学治疗等,存在副作用大等诸多局限,而分子靶向治疗可以选择性杀伤肿瘤细胞,副作用小,因此探索更多治疗肿瘤的分子靶点对肿瘤的治疗具有重要意义。目前有较多文献已经表明核糖体的生物合成过程与肿瘤有着密切的联系,因此认为核糖体生物合成过程中的相关蛋白有望成为很有前景的肿瘤治疗靶点。UTP11是核糖体小亚基的重要调控因子,有研究显示在酵母细胞中Utp11水平降低会影响18S r RNA的合成,并且UTP11基因表达与肿瘤患者生存预后存在相关性。但是UTP11在肿瘤中的功能与作用机制未见报道。本部分将对UTP11在肿瘤中的作用及其机制展开研究,为肿瘤的治疗提供潜在的靶点。研究方法:1.通过公共数据库挖掘、Western blot、实时荧光定量PCR和免疫组织化学实验分析UTP11在肿瘤组织中的表达及其与预后的关系。2.通过细胞增殖,平板克隆,细胞周期及Transwell实验探究UTP11在肿瘤细胞中的作用;裸鼠皮下成瘤实验验证UTP11对肿瘤细胞成瘤能力的影响。3.通过RNA-seq分析UTP11影响肿瘤发展的潜在机制。4.通过免疫印迹(Western blot)和实时荧光定量PCR技术(RT-q PCR)检测在肿瘤细胞中UTP11与p53及其下游靶基因的关系;通过半定量PCR技术、荧光实时定量PCR、免疫荧光和Co-IP实验证实UTP11在18S r RNA合成过程中的重要作用;CHX(cycloheximide)半衰期实验验证敲降UTP11对p53蛋白稳定性的影响;Co-IP实验验证UTP11水平降低的BLZ945采购情况下MDM2与核糖体蛋白RPL5/RPL11相互作用情况;蛋白质泛素化实验验证UTP11水平降低的情况下MDM2对p53蛋白泛素化水平的影响。5.通过Western blot和RT-PCR技术检测在肿瘤细胞中UTP11与SLC7A11和NRF2及其下游靶基因的关系;通过GSH检测试剂盒检测UTP11水平降低对GSH合成的影响;通过RIP实验探究UTP11蛋白与NRF2 m RNA的结合情况;m RNA稳定性实验验证敲降UTP11对NRF2 m RNA稳定性的影响;通过Ch IP实验探究在UTP11水平下调的情况下NRF2对SLC7A11转录水平的影响。研究结果:1.公共数据库以及临床样本分析结果显示:与癌旁组织相比,UTP11在肿瘤组织中高表达,并且与肿瘤患者的不良预后相关。2.细胞实验表明过表达UTP11会促进乳腺癌和肠癌细胞的增殖,克隆形成和迁移能力,而敲降UTP11会抑制乳腺癌和肠癌细胞的增殖,克隆形成和迁移能力。3.RNA-seq分析显示敲降UTP11影响的下游基因可以富集到p53和铁死亡等多条通路。4.Western blot和实时荧光定量PCR实验结果显示,敲降UTP11可以激活p53及其靶基因p21,BTG2以及MDM2的水平;利用半定量PCR技术,荧光实时定量PCR,免疫荧光和Co-IP实验,证实敲降UTP11通过影响核糖体小亚基加工体抑制18S r RNA的生物合成,从而引起核仁应激;通过Co-IP,蛋白质泛素化实验以及CHX蛋白稳定性实验,发现敲降UTP11会促进MDM2与核糖体蛋白RPL5和RPL11的相互作用,抑制MDM2对p53的泛素化降解,从而稳定和激活p53。5.在肠癌细胞HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-中进行的一系列细胞功能实验以及裸鼠皮下成瘤实验,表明敲降UTP11抑制肿瘤的功能部分依赖于p53。鉴于敲降UTP11后抑制肿瘤的功能部分依赖于p53,我们继续探究敲降UTP11后独立于p53发挥抑癌功能的具体机制。6.由于敲降UTP11影响的下游基因可以富集到铁死亡通路,我们验证敲降UTP11是否会通过诱导铁死亡抑制肿瘤生长。通过RNA-seq结果分析,Western blot和实时荧光定量PCR实验证实,敲降UTP11会显著抑制铁死亡通路关键基因SLC7A11的水平;通过GSH检测以及细胞增殖实验证实敲降UTP11抑制GSH合成,并且敲降UTP11抑制细胞增殖的功能可以被铁死亡抑制剂Ferrostatin-1部分回复。7.NRF2是重要的抗氧化转录因子,它可以调节大量抗氧化基因的表达,例如SLC7A11,于是我们考虑敲降UTP11通过NRF2调节SLC7A11的水平。Western blot和RT-PCR实验结果显示,敲降UTP11可以下调NRF2及其靶基因水平,并且不依赖于p53;通过RIP实验和m RNA稳定性实验发现UTP11蛋白会与NRF2 m RNA结合,而敲降UTP11会降低NRF2的m RNA稳定性;通过Ch IP实验揭示敲降UTP11会抑制NRF2对SLC7A11的转录水平。研究结论:UTP11在肿瘤中高表达并与癌症患者的不良预后相关;过表达UTP11促进乳腺癌和肠癌细胞生长,敲降UTP11抑制乳腺癌和肠癌细胞生长;敲降UTP11在体内和体外以依赖和独立于p53两种机制抑制肿瘤细胞的生长:一方面,敲降UTP11通过抑制18S r RNA的生物合成诱发核仁应激,由此通过核糖体蛋白RPL5/RPL11抑制MDM2介导的p53泛素化降解,从而稳定和激活p53;另一方面,敲降UTP11通过促进NRF2的m RNA降解而抑制SLC7A11的水平,导致GSH合成受阻,最终引起铁死亡.第二部分BRIX1通过核仁应激调节肿瘤生长研究背景和目的:核糖体的合成过程是一个多步骤的组装过程,对于维持快速增长的肿瘤细胞中所需的能量至关重要。而由遗传改变、营养缺乏或肿瘤治疗药物刺激等因素引起的核糖体生物合成步骤受阻都会诱发核仁应激,也称为核糖体应激,由此会引起肿瘤细胞周期阻滞和凋亡等。BRIX1是核糖体大亚基的重要调节因子,目前有研究表明Brix在非洲爪蟾和酵母中参与了pre-RNA的加工过程,以及会与Ebp2协同作用促进60S核糖体大亚基的合成。并且有研究表明BRIX1可以作为肝癌、胃癌以及肠癌的潜在治疗靶点。但是BRIX1在肿瘤中的功能及具体机制尚不清楚,于是本部分将对BRIX1在肿瘤中的作用及其机制展开研究,为BRIX1成为肿瘤治疗靶点提供更多的理论依据。研究方法:1selleckchem PLX4032.通过公共数据库分析以及免疫印迹(Western blot),实时荧光定量PCR技术(RT-q PCR)和免疫组织化学技术(IHC)分析BRIX1在多种肿瘤中的表达及其与预后的关系。2.通过细胞增殖,克隆形成,细胞凋亡,细胞周期及Transwell实验探究BRIX1在肿瘤中的功能。3.通过RNA-seq分析BRIX1影响肿瘤发展的潜在机制。4.通过Western blot和RT-q PCR技术检测在多种肿瘤细胞中BRIX1与p53及其靶基因p21,BTG2和MDM2的关系;利用半定量PCR技术,荧光实时定量PCR,免疫荧光和Co-IP实验证实BRIX1在28S r RNA合成过程中的重要作用;CHX半衰期实验验证敲降BRIX1对p53蛋白稳定性的影响;Co-IP实验验证BRIX1水平降低的情况下MDM2与和核糖体蛋白RPL5/RPL11相互作用情况;泛素化实验验证BRIX1水平降低的情况下MDM2对p53泛素化水平的影响。5.在肠癌细胞HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-中进行一系列细胞功能以及裸鼠皮下成瘤实验验证BRIX1调节肿瘤生长的功能是否依赖于p53。研究结果:1.公共数据库以及临床样本分析结果显示:与癌旁组织相比,BRIX1在肿瘤组织中高表达,并与肿瘤患者的不良预后相关。2.细胞功实验表明,过表达BRIX1会促进乳ventriculostomy-associated infection腺癌细胞生长,而敲降BRIX1会抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移。3.在机制上,通过分析RNA-seq结果我们发现敲降BRIX1影响的下游基因可以富集到p53通路。4.通过Western blot,实时荧光定量PCR实验证实敲降BRIX1可以激活p53及其靶基因;利用半定量PCR技术,荧光实时定量PCR,Co-IP和免疫荧光实验证实BRIX1与Pe Bo W复合物中BOP1和PES1相互作用,因此BRIX1水平的降低会通过影响Pe Bo W复合物抑制28S r RNA的生物合成,从而引起核仁应激;接下来进一步通过Co-IP,泛素化和CHX蛋白稳定性实验发现敲降BRIX1会促进MDM2与核糖体蛋白RPL5和RPL11的相互作用,抑制MDM2对p53的泛素化降解,从而稳定和激活p53。5.在一组肠癌细胞HCT116 p53+/+and HCT116 p53-/-中进行细胞功能和裸鼠皮下成瘤实验表明BRIX1调节肿瘤细胞生长的功能主要依赖于p53。研究结论:BRIX1在肿瘤中高表达并且与肿瘤患者的不良预后相关。在功能上,过表达BRIX1会促进肿瘤细胞生长,敲降BRIX1可以抑制肿瘤的体内及体外生长,并且主要依赖于p53。在机制上,敲降BRIX1可以通过影响Pe Bow复合物阻碍28S r RNA的生物合成,诱发核仁应激,并通过增加核糖体蛋白RPL5和RPL11与MDM2的相互作用,抑制MDM2对p53的泛素化降解,从而稳定和激活p53。