西洋参Panaxquinquefolium L.是五加科人参属多年生药用植物,具有抗炎、抗肿瘤、调节免疫等功效,目前在我国吉林、辽宁、山东等地广泛种植。随着西洋参栽培面积扩大及种植年Normalized phylogenetic profiling (NPP)份的增加,病害已经成为影响其产量和质量的主要障碍,其中根腐病是最常见的地下病害,灰霉病和黑斑病则主要危害西洋参地上部分。植物营养状态是影响病害发生的重要因素,通过营养调控减少病害发生是绿色防控技术的重要组成部分。课题组前期研究发现钙作为植物必需的营养元素对西洋参生长GSK J4的影响仅次于氮和钾,缺钙显著降低西洋参生长;对主产区山东省威海市文登区22块种植地的调查发现,生产上栽培西洋参土壤的有效钙含量相差33倍以上。然而截止目前西洋参对钙的需求量及钙对西洋参病害发生的作用研究几乎为空白。为此本文在钙对西洋参生长及3种主要病害的影响方面展开研究,并初步探究钙减轻病害的生理及分子机制,旨在为西洋参钙肥合理施用以及病害防治提供参考。研究结果如下:1.外源钙对西洋参生长及质量的影响以两年生西洋参为材料,通过室内沙培试验(营养液CaC12浓度为0、0.56、1.11、2.22、3.33 g.L-1,试验周期42 d)和田间盆栽试验(土壤中CaO添加量为0、0.5、1.5、4.5 g.kg-1,试验周期80 d),测定西洋参株高、叶面积、生物量、皂苷含量和营养元素吸收。沙培试验结果表明:西洋参地下和地上部分的钙含量随Ca添加浓度增加逐渐上升,3.33 g.L-1处理组与对照相比分别增加42.63%、148.65%(p<0.05),且地上部分钙含量高于地下部分。Ca主要影响西洋参地上部分生长,地上鲜重在0.56 g·kg-1处理组有最大值,而后随浓度增加逐Entinostat体内实验剂量渐降低。田间盆栽结果表明:西洋参株高和叶面积受Ca处理影响较大,0.5 g·kg-1处理组与对照相比,第6周的株高和叶面积分别增加22.73%、44.93%(p<0.05)。Ca处理80 d后,根内总皂苷含量在0.5 g·kg-1处理组有最大值(p>0.05)。2.外源钙对西洋参根腐病的影响机制以西洋参根腐病的2种病原菌Fusarium.solani和Ilyonectria.mors-panacis为防治对象,设置田间盆栽接种试验,测定土壤中施用不同剂量的氧化钙(0、0.5、1.5、4.5 g·kg-1)对西洋参根生长的影响和对病害的防治效果,以及根内营养元素吸收、土壤化学性质、土壤微生物群落的差异。结果发现,添加钙对西洋参根腐病的作用出现“低促高抑”的现象。与对照相比,氧化钙添加量达到4.5 g·kg-1时,接种I.mors-panacis、F.solani引起的根腐病病情指数分别降低 87.69%(p<0.05)、66.67%(p>0.05),此时根内钙含量分别提高101.28%和61.50%(p<0.05),根内氮磷含量与接种F.solani组病情指数呈正相关。接种2种病原菌的土壤微生物群落结构及组成存在明显差异。钙主要影响土壤真菌多样性及群落组成,高钙(4.5 g·kg-1)情况下亚隔孢壳属Didymella、茎点霉属Phoma的相对丰度均降低;而钙对细菌群落影响较小。综上,高剂量钙可以降低西洋参根腐病65%以上,其潜在的机制与增加根内钙含量、降低氮、磷含量以及减少土壤中潜在病原菌属的相对丰度有关。研究结果将为合理施用钙肥减轻西洋参根腐病提供理论依据。设计 0%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%不同浓度 CaCl2对F.solani和I.mors-panacis菌丝生长的离体作用试验,结果表明,高浓度的CaCl2(>3.2%)对F.solani具有抑制作用,对I.mors-panacis具有促进作用(p<0.05)。为探究外源钙诱导西洋参根对病原菌侵染的防御反应,采用0.4%CaCl2处理离体西洋参根,再分别接种F.solani和I.mors-panacis,于接种后6h、12 h、24 h、72 h测定西洋参根内PRs基因(PR4、PR6、PR10),以及茉莉酸合成途径相关基因(AOS1、AOC1、JAR1)的表达。结果表明:与对照组相比,Ca处理组可以减轻由F.solani引起的西洋参根腐病症状,3个抗病相关PR基因在接种72 h表达开始明显上调,但只有PR4高于对照组;另外,Ca处理组参根中茉莉酸含量在接种后6h显著高于对照组(p<0.05),但此时处理组3个茉莉酸合成途径相关基因并没有高于对照组,在接种后12～72 h,只有AOS1相对表达高于对照组,且在12 h最为明显,提高4.76倍(p<0.05)。Ca处理对…I.mors-panacis引起的西洋参根腐病没有明显作用,在接种72h时,Ca处理组的PR4、PR6、PR10相对表达均低于对照组,其中PR6表达显著降低(p<0.05);而3个茉莉酸合成相关基因AOS1、AOC1、JAR1的相对表达量在接种后72h时,虽然高于对照组,但没有显著差异(p>0.05)。3.外源钙对西洋参叶部病害的影响及作用机制的初步解析在试验设计的CaCl2浓度范围内(0.1%～3.2%),0.4%CaC12浓度对灰霉菌Botrytis cinerea的抑制作用为6.11%(p<0.05)。为探究外源Ca诱导西洋参叶片对灰霉菌侵染的抗性反应,以三年生离体西洋参叶片为材料,将水或0.4%Ca处理后的西洋参叶片接种B.cinerea,接种后36 h和72 h进行转录组测序分析。结果发现:Ca处理组与水对照组相比,灰霉病症状有所减轻。Ca处理组在接种后36h有44个差异表达基因,72 h增加至142个。KEGG通路分析发现,接种后36 h,差异表达基因主要参与谷胱甘肽代、半胱氨酸和蛋氨酸代谢;接种后72 h,差异表达基因主要参与苯丙烷类生物合成、植物激素信号转导和植物-病原互作等通路,这些通路中的基因表达可能在Ca介导的西洋参叶片抗灰霉菌侵染的过程中发挥重要作用。不同Ca浓度(0.1%～3.2%CaCl2)对2株黑斑病菌Alternariapanax(5747菌株,Q和6197菌株,R)生长的作用表明,0.4%CaCl2浓度对两株病原菌的促进作用分别为22.00%、27.80%(p<0.05)。为探究外源Ca诱导西洋参叶片对黑斑菌侵染的抗性反应,以三年生离体西洋参叶片为材料,将水或0.4%Ca处理后的西洋参叶片分别接种2株黑斑病菌,接种后36 h和72 h进行转录组测序分析。结果发现:接种后72 h,Ca处理组与水对照组相比,两株菌引起的症状没有明显差异。针对Q菌株侵染,Ca处理的西洋参叶片在接种后36 h共有89个特有差异表达基因,72 h增加至276个。KEGG通路分析发现,在36 h,参与类黄酮生物合成通路中的差异表达基因最多;在72h,参与植物激素信号转导的差异表达基因数目最多;参与植物-病原互作通路的基因在两个时间点均较多。针对R菌株侵染,Ca处理的西洋参叶片在接种后36 h共有580个特有差异表达基因,72 h减少至312个。KEGG通路分析发现,在36h,参与苯丙烷类生物合成的差异表达基因数目最多;在72h,植物-病原互作通路的差异表达基因最多;参与植物激素信号转导的差异基因在两个时间点均较多。相比之下,Ca介导的西洋参叶片中抗性相关基因对R菌株的应答多于Q菌株。