目的NK/T细胞淋巴瘤是一种侵袭性极强的EB病毒阳性非霍奇金淋巴瘤。该疾病主要在东亚地区的中青年男性中高发。目前,常用selleck NMR的放疗和化疗方案对晚期和高风险的NK/T细胞淋巴瘤而言疗效较差,免疫治疗方案缺乏前瞻性研究,生物治疗方案的安全性和复杂性问题仍未解决。相较于耗费巨大财力的新药开发,增强现有抗肿瘤药物的疗效是更加具有成本效益和实用性的。地西他滨和吉西他滨是临床中常用的抗肿瘤药物。地西他滨为常用的甲基化抑制剂,吉西他滨为NK/T细胞淋巴瘤化疗方案中较为常见的细胞毒性药物,且两种药物对于EB病毒有较好的裂解作用。故本研究旨在探究地西他滨和吉西他滨联合用药对NK/T细胞淋巴瘤细胞增殖的影响,分析联合用药对EB病毒裂解循环的作用,从分子层面探究联合用药对NK/T细胞淋巴瘤的作用机制,为临床上治疗NK/T细胞淋巴瘤提供新的思路和靶点。方法1.细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测细胞增殖情况:利用CCK-8试剂盒检测地西他滨和吉西他滨和对人NK/T细胞淋巴瘤细胞系NK92MI细胞增殖的影响。通过Chou-Talalay数学模型计算两药物联合用药后的协同指数,以评估联合用药是否具有协同效应。2.转录组测序技术检测药物处理后m RNA表达谱的变化:实验分组包括地西他滨+吉西他滨联合用药组、地西他滨单药组、吉西他滨单药组和对照组。药物处理NK92MI细胞48小时后利用二代测序技术检测各组m RNA表达谱。通过生物信息学分析地西他滨+吉西他滨联合用药组、地西他滨单药组、吉西他滨单药组和对照组相比的差异表达基因,以及差异表达基因主要影响的信号通路。3.实时定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测差异表达基因、GPX4、EBV裂解基因的m RNA表达量:地西他滨和吉西他滨单独或联合处理NK92MI细胞48小时后利用q RT-PCR实验检测各组的差异表达基因HMOX1和SLC7A11以及EB病毒裂解基因BRLF1、BZLF1的m RNA表达量。检测各组中与HMOX1和SLC7A11调控相关的分子GPX4的m RNA表达量。4.蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)实验检测差异基因对应的蛋白、凋亡相关蛋白和GPX4蛋白:地西他滨和吉西他滨单独或联合处理NK92MI细胞48小时后利用WB实验检测各组的HMOX1、SLC7A11、GPX4和Caspase3的蛋白水平。5.流式细胞术检测细胞凋亡情况和活性氧水平:地西他滨和吉西他滨单独或联合处理NK92MI细胞48小时后利用流式细胞术和Annexin V-FTIC/PI染色法检测各组细胞凋亡情况。利用流式细胞术和DCFH-DA染色检测各组细胞活性氧水平。结果1.对地西他滨和吉西他滨处理后的NK92MI细胞的增殖抑制率进行分析。结果显示,地西他滨对NK92MI细胞呈剂量依赖性的增殖抑制作用;吉西他滨对NK92MI细胞呈剂量依赖性的增殖抑制作用。不同浓度的地西他滨和吉西他滨联合处理NK92MI细胞的抑制率均高于两种药物单独处理细胞的抑制率,且联合用药的协同指数均小于1,表明地西他滨与吉西他滨联合使用selleck Dolutegravir有显著的协同效应。最佳协同效应的地西他滨浓度为4.046μM,吉西他滨浓度为0.005μM。2.对地西他滨和吉西他滨联合使用处理后的NK92MI细胞的转录组测序结果进行生物信息分析。结果显示,联合用药诱导了NK92MI细胞基因表达谱的变化,联合用药后的差异基因主要富集在调控细胞凋亡、细胞增殖、细胞粘着信号通路上。3.验证经筛选的差异表达基因HMOX1、SLC7A11、GPX4、BRLF1和BZLF1在地西他滨和吉西他滨联合处理后的NK92MI细胞中的m RNA水平。结果显示,与对照组、地西他滨单药组、吉西他滨单药组相比,地西他滨+吉西他滨联合用药组中HMOX1的表达上调(P<0.05),SLC7A11的表达下调(P<0.05),EB病毒裂解基因BRLF1(P<0.05)和BZroot canal disinfectionLF1(P<0.05)的表达均上调。与对照组、地西他滨单药组相比地西他滨+吉西他滨组联合用药组中GPX4的表达被显著下调(P<0.05),但与吉西他滨单药组相比,地西他滨+吉西他滨联合用药组中GPX4的表达并未显著下调。4.对地西他滨和吉西他滨处理后的NK92MI细胞中HMOX1、SLC7A11、GPX4和Caspase3的蛋白表达水平进行验证。结果显示,与对照组、地西他滨单药组、吉西他滨单药组相比,地西他滨+吉西他滨联合用药组中HMOX1和Caspase3的蛋白表达增加(P<0.05),SLC7A11和GPX4的蛋白表达减少(P<0.05)。5.对地西他滨和吉西他滨联合使用处理后的NK92MI细胞凋亡情况进行分析。结果显示,与对照组、地西他滨单药组、吉西他滨单药组相比,地西他滨+吉西他滨联合用药组的细胞总凋亡率显著增多(P<0.05)。6.对地西他滨和吉西他滨联合使用处理后的NK92MI细胞活性氧水平进行分析。结果显示,与对照组、地西他滨单药组、吉西他滨单药组相比,地西他滨+吉西他滨联合用药组NK92MI细胞的活性氧水平升高(P<0.05)。结论1.低剂量的地西他滨和吉西他滨联合使用可以协同抑制NK/T细胞淋巴瘤细胞系NK92MI细胞增殖。2.低剂量的地西他滨和吉西他滨联合使用可以促进NK92MI细胞凋亡。3.低剂量的地西他滨和吉西他滨联合使用与单药作用相比,NK92MI细胞的基因表达谱有所改变,与铁死亡相关分子表达增加,NK92MI细胞内活性氧蓄积增加。4.低剂量的地西他滨和吉西他滨联合可能通过促进EB病毒裂解基因BRLF1和BZLF1的表达从而促进EB病毒从潜伏状态转至裂解状态。5.地西他滨和吉西他滨联合用药激活HMOX1表达,降低了SLC7A11的表达,可能激活铁死亡和(或)氧化应激促进了肿瘤细胞死亡,故检测HMOX1、SLC7A11的表达变化可用于联合用药治疗NK/T细胞淋巴瘤的疗效检测。