背景与目的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是以非胰岛素依赖的高血糖为特征的内分泌疾病,严重危害全球公共健康。骨再vaccine-preventable infection生不良是T2DM的并发症之一,表现为骨量减少、骨微结构异常和骨稳态失衡,极大地增加了骨折等风险。Maresin1(MaR1)是ω-3脂肪酸的衍生代谢产物之一,具有抗氧化、促进组织再生等重要生理作用,但其具体机制尚不明确。研究表明,抗氧化关键因子核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)受到MaR1的调节,并通过影响铁代谢、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、脂质过氧化等过程抑制细胞铁死亡。因此,本研究旨在探究MaR1对T2DM状态下成骨功能的影响,并深入探讨NRF2及铁死亡在MaR1调控骨再生中的作用,为T2DM条件下的骨再生提供新的治疗思路。材料与方法1、Maresin1对高糖状态下成骨细胞功能的影响培养 MC3T3-E1 成骨细胞系,分为 Normal 组、T2DM 组、T2DM+MaR1(1 nM)组和T2DM+MaR1(10nM)组,通过EdU荧光染色法、CCK-8法检测细胞增殖情况,通过蛋白质印迹法(western blot)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和茜素红S(alizarin red S,ARS)矿化结节实验检测成骨矿化能力。2、NRF2在Maresin1改善高糖状态下成骨细胞功能中的作用通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术敲低NRF2,利用免疫荧光染色、Western blot检测敲低效率。建立Normal组、T2DM组、T2DM+MaR1组、T2DM+MaR1+siNC组和T2DM+MaR1+siNRF2组,检测成骨细胞增殖及成骨矿化能力。3、NRF2-铁死亡轴在Maresin1改善高糖状态下成骨细胞功能中的作用在前一部分基础上使用铁死亡促进剂,即增加T2DM+MaR1+Era组,探讨NRF2-铁死亡轴在MaR1的药理机制中的影响。使用CCK-8检测细胞活力;通过检测GSH、铁离子、丙二醛、脂质活性氧、细胞内活性氧评价脂质过氧化程度;通过Western blot测定铁死亡标志物胱氨酸-谷氨酸逆向转运蛋白(cystine-glutamate antiporter,SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)表达:利用透射电子显微镜观察线粒体形态。全面评价细胞成骨能力,方法同第一部分。4、Maresin1对2型糖尿病大鼠颅骨骨再生的作用采用20只4周雄性Sprague Dawley大鼠,随机分为Normal组、T2DM组、T2DM+Vehicle组、T2DM+MaR1组。通过高糖高脂饮食1月联合STZ腹腔注射的方法构建T2DM大鼠模型。在大鼠颅骨双侧建立直径5 mm的圆形缺损区。T2DM+MaR1组在骨缺损区置入浸润MaR1的明胶海绵;作为对照,T2DM+Vehicle组所置明胶海绵浸润等量无菌生理盐水。术后28天采用Micro-CT、双荧光标记、苏木素-伊红染色等方法评估骨再生情况;利用免疫组织化学染色检测NRF2和GPX4表达。结果1、Maresin1显著改善高糖环境下成骨细胞生物ABT-199采购学功能T2DM组成骨细胞的增殖和分化能力明显减弱,MaR1可恢复细胞增殖活性、提升矿化能力。2、NRF2是Maresin1改善高糖环境下成骨细胞生物学功能的关键蛋白免疫荧光和Western blot实验证实了 MaR1能提高NRF2整体表达并促进其入核。利用siRNA敲低NRF2后,MaR1改善成骨效selleck合成果被削弱,表现为成骨分化相关蛋白表达下调和ALP染色阳性表达区域减少。3、NRF2-铁死亡轴是Maresin1改善高糖环境下成骨细胞生物学功能的关键通路T2DM培养基、铁死亡促进剂和NRF2-siRNA严重扰乱GSH氧化还原系统,导致铁离子过度积累,并显著降低GPX4和SLC7A11表达,加剧脂质过氧化,细胞线粒体形态出现异常;同时成骨细胞增殖活性明显下降,细胞成骨能力被显著抑制。4、Maresin1显著促进2型糖尿病大鼠颅骨骨再生高糖高脂饮食喂养合并小剂量注射链脲佐菌素可成功建立T2DM大鼠模型。MaR1能显著增加T2DM大鼠颅骨缺损区的新生骨骨量,使得旧骨边缘和新骨处钙沉积更活跃,并且NRF2和GPX4的免疫反应性明显增加。结论1、MaR1促进高糖环境下成骨细胞增殖和分化。2、NRF2是MaR1促进高糖环境下成骨过程的关键蛋白。3、MaR1通过激活NRF2减少高糖诱导的成骨细胞铁死亡,其对NRF2-铁死亡轴的调控恢复了成骨活性。4、T2DM大鼠颅骨缺损模型骨重建效果不佳,在骨缺损区添加MaR1可改善与T2DM相关的NRF2抗氧化系统与铁死亡途径的紊乱失调,促进新骨再生。