柚是芸香科柑橘属常绿果树,为柑橘属植物的三大基本种之一,在柑橘属植物群体资源利用以及市场消费结构中占据重要地位。果肉颜色是柚重要的品质性状,也是影响柚产业发展的重要因素。柚的果肉颜色形成主要受类胡萝卜素的影响,类胡萝Metabolism抑制剂卜素是决定柚果肉成熟时显色的一类重要色素,具有丰富的营养价值,在动植物中均具有重要作用。因此,类胡萝卜素作为影响柚外观品质和营养价值的色素化合物,成为了育种工作者对柚进行育种改良的重要突破点。在类胡萝卜素的积累过程中,合成通路上相关基因的表达及代谢调控因子的作用对其产生影响。研究显示,类胡萝卜素合成通路相关基因在不同材料中往往存在丰富的序列变异,导致类胡萝卜素相关基因的功能受到影响进而造成颜色差异。同时,由于柚果树童期长、杂交群体占地面积大、遗传背景复杂等多因素影响,对于其果肉颜色的代谢调控网络和相关基因还知之甚少,而通过构建遗传杂交群体来对果肉颜色的相关调控因子进行精细挖掘及定位耗时长且难度大。因此,本研究对类胡萝卜素合成通路上11个基因(PSY1、PDS、ZDS、LCYB2、LCYE、BCH1、ZEP、VDE、NSY、NCED3、CCD4)进行靶向测序以挖掘其序列变异对果肉颜色的影响;同时结合GBS全基因组测序分析方法对柚果肉颜色进行关联分析研究,以挖掘与柚果肉呈色的相关位点和相关基因,为理解果肉颜色这个复杂的表型性状提供思路,进一步为柚的育种改良提供参考。本文主要研究结果如下:(1)对现有的157份柚资源进行了果肉颜色鉴定、统计和多样性分析。利用colormeter pro色差仪、Photoshop软件对81份白肉柚、46份红肉柚及30份黄肉柚的颜色参数进行统计,结果显示色泽指数L、a、b、C、H、CCI在不同果肉颜色的柚材料中变异范围较大,对不同色泽参数进行分析可筛选出与颜色表型记录吻合的材料。同时不同果肉颜色的柚材料在a、b、C、H以及CCI分析下有明显的聚类现象,通过a、b、C、H以及CCI等颜色参数可大致明晰不同材料之间的颜色差异范围。(2)依托本实验室二代测序平台芯片兼容样本数大小,选取了96份柚对11个类胡萝卜素合成代谢有关的结构基因(PSY1、PDS、ZDS、LCYB2、LCYE、BCH1、ZEP、VDE、NSY、NCED3、CCD4)进行了靶向测序分析。分别选择了6份白肉柚、6份红肉柚及6份黄肉柚对上述11个基因进行了表达模式分析。结果发现11个基因的表达模式在不同材料中存在复杂多样性,单一基因的高表达或低表达并不能直接判断果肉颜色深浅。在白肉柚中,PSY1基因在发育期表达量不断降低有关,限制了上游类胡萝卜素的代谢通量,使得色素积累减少;红肉柚中,上游基因表达量较高,而番茄红素环化支路相关基因表达量较低,限制了番茄红素向下游产物转化的过程,使得果肉变红;在黄肉柚中,下游基因BCH1、ZEP表达量较低,可能导致β-胡萝卜素的积累使得果肉变黄。对11个基因的靶向测序结果显示,测序数据为2.067 Gb,Q 30≥93.39%,平均每份样本数据量为21.53 Mb,经过SNP calling及过滤后共得到1046个高Cerebrospinal fluid biomarkers质量SNP。提取不同基因变异位点信息发现,LCYB2基因变异频率最低,为1 SNP/53此网站.7 bp,ZDS变异频率最高,为1 SNP/22.8bp。基于11个基因的SNP对96份材料进行群体结构研究发现,黄肉柚和红肉柚有较好的群体聚类效果,而白肉柚的的划分结果较为混杂。选用MLM关联分析模型对果肉颜色进行关联分析,共筛选到14个显著变异位点(-log_(10)P>2.5)。其中9个位点位于PSY1基因,3个位点位于LCYE基因,12个位点均对应到基因的内含子;2个位点位于ZEP基因,分布在该基因的外显子上。提取每个位点对应的基因型分析发现,不同基因型所对应的材料果肉色差值均存在显著差异,能够利用不同位点基因型对果肉颜色进行初步预测。(3)对红肉柚和白肉柚共100份材料进行了GBS全基因组测序分析。经过滤筛选后得到了121726个高质量SNP,基于过滤后的SNP对白肉柚和红肉柚没有明显的分层效果。结合前期表型鉴定结果通过GWAS全基因组关联分析以及Fst遗传分化分析共定位到位于7号染色体上的6个SNP位点(Fst>0.4且-log_(10)P>9),且在变异位点上游约55 kb位置发现直接参与类胡萝卜素降解途径的基因CCD4。通过对6个变异位点的等位变异分析发现,这些位点的不同基因型可以用于果肉颜色的判断。对显著关联位点邻近区域进行注释后筛选了14个基因作为候选基因,经过基因表达量分析发现,Cg7g013760(促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶MAPKKK17)、Cg7g013840(胆色素原脱氨酶PBGD)、Cg7g014020(转录因子TCP7)、Cg7g014120(超氧化物歧化酶SOD3)、Cg7g014190(FAD合成酶2)、Cg7g014430(乙烯应答转录因子ERF119)6个基因可能参与了柚的果肉颜色形成。