肿瘤抑制蛋白p53通过转录调控促进细胞周期阻滞和细胞凋亡获悉更多来阻止肿瘤发生,然而p53功能异常在人类癌症中频繁发生。因此,p53成为抗癌治疗的最有希望靶点之一。细菌效应蛋白Azurin是致病菌铜绿假胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌的铜氧化还原蛋白,效应蛋白Azurin通过稳定p53并提高其蛋白水平来触发肿瘤抑制。目前,关于Azurin通过稳定p53并提高其蛋白水平来抑制肿瘤的发生已经有很多研究。但Azurin蛋白介导肿瘤抑制的结构和机制基础仍然不清楚。因此通过“细菌效应蛋白Azurin靶向肿瘤抑制因子p53并抑制其泛素化的分子机制研究”获得以下的结果:1、解析p53-DBD/Azurin复合物高分辨率的晶体结构我们通过蛋白优化以及复合筛选,使MK-4827 IC50用大肠杆菌表达系统异源表达并纯化出蛋白性质均一、稳定的p53-DBD/Azurin复合物。通过大量实验对蛋白结晶条件进行优化,获得衍射很好的蛋白晶体,并收取衍射数据。成功解析分辨率为2.2?的p53-DBD/Azurin复合物结构。同时使用液体核磁共振验证了p53-DBD/Azurin复合物的结构。2、揭示了p53-DBD/Azurin复合物互作界面我们通过结合X-射线晶体和核磁共振技术,确定了Azurin蛋白介导p53稳定的原子细节以及互作界面。p53-DBD与Azurin通过独特的互作界面稳定复合体,该复合物的相互作用界面主要由Azurin蛋白上p28(55-78)小肽介导。3、阐明了Azurin稳定p53蛋白的hip infection结构机制基于复合物结构设计突变体进行pull down分析,结果显示互作界面上关键氨基酸以及p28对维持复合物相互作用以及稳定具有重要作用,同时Azurin蛋白的p28有助于Azurin与p53的结合。体外泛素化分析表明,Azurin可以特异性抑制组成型光形态建成1蛋白COP1(constitutively photomorphogenic 1)和p53结合,从而抑制p53的泛素化降解。4、设计增强与p53亲和力的Azurin突变体由于p53与Azurin为瞬时相互作用,这成为Azurin及抑癌小肽特异性抑癌效果的主要障碍。因此根据Azurin通过抑制COP1介导的p53泛素化和降解来稳定p53的研究基础,并基于复合物结构,我们通过pull down及体外泛素化实验获得了几个与p53亲和力增强的Azurin突变体,这些Azurin突变体比野生型显著增强对p53的稳定性以及显著抑制COP1对p53的泛素化修饰。5、增强亲和力的Azurin突变体促进p53调控细胞凋亡我们发现,与野生型Azurin相比,增强亲和力的Azurin突变体显著增强p53的稳定性,并诱导下游细胞凋亡蛋白BAX及细胞周期停滞蛋白p21的表达。这些结果为了解Azurin如何稳定p53以及抑制COP1对p53的泛素化修饰提供了结构信息,同时复合结构可以为用于癌症治疗的Azurin以及衍生物设计提供理论基础。