非洲猪瘟(African Swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染猪引起的一种急性、烈性、出血性、高度接触性的动物传染病,具有病程短、感染能力强、感染范围广、发病率和死亡率高等特点,对世界生猪产业危害巨大。安全、有效的ASFV疫苗研发对ASF的防控具有重要意义,目前尚无安全有效的商品化ASFV疫苗。体液免疫作为机体免疫适应性免疫的重要组成之一,对ASFV疫苗发挥免疫保护作用尤为重要。前期研究表明ASFV抗原免疫能够产生特异性抗体,但无法为猪只提供完全免疫保护和异源保护,这是因为对ASFV主要免疫原认识不全面、对保护性抗原的定位不清楚。本研究通过噬菌体高通量筛更多选、制备单克隆抗体和合成多肽等多种技术方法研究ASFV感染过程中参与体液免疫的关键抗原,明晰关键抗原在激发机体免疫过程中的作用及免疫分子机制,有助于ASFV疫苗的研发。针对ASFV体液免疫关键抗原及表位信息不明确,本研究进行了ASFV体液免疫相关抗原的表位筛选、验证及表位肽重组蛋白的初步设计应用等工作。(1)利用ASF阳性血清结合噬菌体肽库筛选技术、扩增子高通量测序技术,筛选分析ASF阳性血清中产生特异性抗体所对应的抗原类型,共获得166种ASFV抗原,其中包括ASFV结构蛋白34种、非结构蛋白55种、未知功能蛋白77种,抗原表位5540种,对筛选的部分抗原表位在蛋白结构上进行展示,显示筛选获得的表位属于线性表位,Western blot验证筛选的部分ASFV抗原,这些抗原与ASF阳性血清均具有良好的反应原性。(2)为了获得更多表位信息,针对试验一中筛选获得的ASFV抗原p E165R(ASFV d UTPase),通过单克隆抗体制备技术获得了19株能特异性识别ASFV d UTPase的单克隆抗体,分析ASFV d UTPase主要的抗原区域为:100-120 aa,120-140 aa和140-165 aa,获得了一株(8F9 m Ab)能够显著性抑制ASFV d UTPase催化活性且与猪源的d UTPase无交叉反应的单克隆抗体,鉴定其识别表位区域为:149–RGEGRFGSTG–158 aa,该表位在所有的ASFV毒株中保守性达到100%,通过对8F9 m Ab抗体结构重构与结合表位的对接分析,阐明了8F9特异性结合ASFV d UTPase的关键氨基酸位点(Glu151、Arg153)。(3)对筛选获得的ASFV部分体液免疫相关抗原,通过免疫信息学方法分析鉴定抗原的BCE、CTL、MHC等免疫表位,并联合高通量筛选的表位信息进行合并分析确定关键抗原表位。之后我们利用合成的关键抗原表位多肽,进行了Dot blot反应原性验证、体外刺激细胞评价及偶联牛血清白蛋白(BSA)后进行小鼠免疫评价。在合成的45条表位中共筛选到43个与ASF寻找更多阳性血清发生特异性反应的抗原表位。在多肽偶联载体免疫试验中,p72-EP-1能够显著增强提高小鼠脾脏淋巴细胞中CD4~+细胞比例,而p37-EP能够显著降低小鼠脾脏淋巴细胞中CD4~+细胞比例。p37-EP、p72-EP-2、p15-EP能够显著提高小鼠脾脏中CD8~+细胞比例。p72-EP-1、p72-EP-2、p15-EP、p37-EP免疫小鼠引发的免疫应答偏向于Th1型细胞免疫,而p72(423-641 aa)、p150(64-190 aa)、p150-EP、p15、p37、EP153R-EP免疫小鼠引起的免疫应答偏向于Th2型的体液免疫。在多肽偶联载体免疫试验中,p37-EP、EP153R-EP免疫组对IL-4、IL-6、IL-12、IFN-α6、IFN-β、IFN-γ基因转录均具有显著的增强作用,而p72-EP-1免疫显著增强了IFN-α6基因的转录。p72-EP-2、p150-EP、p37-EP、EP153R-EP显著提升了小鼠血清中IL-4,而p37-EP显著提升小鼠血清中IL-6含量。p37-EP、p150-EP免疫组中IL-12含量显著上升,而p72、p72-EP-2、p37-EP、EP153R-EP免疫显著提升小鼠血清中IFN-α含量。p37-EP免疫组小鼠血清中IFN-β含量显著上升,而p150-EP、p37-EP免疫组小鼠血清中IFN-γ含量显著上升。(4)基于前期筛选验证的ASFV抗原表位信息,利用Rosetta protein Multiple immune defectsdesign软件设计了ASFV重组表位肽蛋白(REP-23),结构预测显示REP蛋白单体结构类似“三叶草”,凝胶过滤层析表明REP-23蛋白能够形成三聚体结构,通过对REP-23蛋白进行初步的评价及验证,结果表明设计的REP-23蛋白无显著的细胞毒性与ASF阳性血清、表位对应的单克隆抗体均具有良好的反应原性。体外孵育刺激猪源PBMC结果显示,REP-23蛋白能够增强多种细胞因子转录水平。综上所述,本研究获得了ASFV体液免疫过程中相关抗原及其表位信息,分析评价部分ASFV抗原及其表位的免疫学反应特性,最后基于筛选评价结果尝试开发ASFV重组表位肽蛋白,并进行初步评价。本研究为研发ASFV亚单位疫苗提供关键抗原信息,也为研发新型表位疫苗提供新思路。