地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)作为革兰氏阳性菌模式菌株与食品安全菌株,在工业发酵领域具有广泛应用。近年来,旨在重新编程生命系统的合成生物学快速发展,通过重塑机体代谢网络实现既定的目标。而碳分解代谢抑制效应(CCR)引导的代谢底物的转录再编程会对预设代谢网络产生波动干扰。CCR效应是普遍存在于各类微生物中一种用于碳流量分配的效应,尽管实现的方式不同,但内在逻辑是一致的。在革兰氏阳性菌中,这一效应是由CcpA(carbon catabolite protein A)与cre(catabolite responsive element)位点相互作用而驱动。只有清晰地了解CcpA-cre相互作用的分子机制,才能通过理性设计对碳流量进行再分配。本研究选择具备广泛碳底物谱的B.licheniformis为研究对象,对CcpA-cre相互作用的分子机制展开系统研究。主要研究结果如下:(1)B.licheniformis cre基序的建模及表征。首先通过对20个B.licheniformis近缘菌株中明确报道的cre位点进行建库,得到B.licheniformis位点的基序为TGWMARCGHTWWHW。按照这一基序在B.licheniformis基因组中鉴定出126个靶点,揭示出cre靶点分布的广泛性。其次,以glv操纵子以及mtl操纵子为研究对象表明CcpA-cre相互作用是介导葡萄糖存在GSK2118436下CCR效应的关键因素,这一效应的生理意义在于当葡萄糖耗尽后加速受抑制碳源(例如麦芽糖与甘露醇)的底物代谢。最后,基于cre位点的元件工程通过消除CcpA蛋白的敏感性提升了指示产物101.41%的活性。(2)挖掘并鉴定了一类新型cre基序,实现了对不同效应物的可编程多模块的协同调控。首先,鉴定出一个由回文区(AGCTTT/AAAGCT)及间隔区组成的靶点,其特征在于间隔区的非保守性及回文区的保守性。其次,CcpA与该cre基序的相互作用介导了葡萄糖存在下的碳分解代谢激活效应(CCAMC3体外),而该cre基序回文区的颠倒(AAAGCT/AGCTTT)逆转CCA为CCR。最后,基于cre元件与甘露醇元件的杂合遗传回路可以通genetic program过效应物切换ON-OFF状态,并且优化后可以使得OFF值比基准值降低90.69%,消除了背景干扰。(3)挖掘并鉴定了一类cre退化位点基序,揭示了CcpA-cre调控的替代策略。首先,比较野生型菌株与CcpA缺失型菌株在底物利用方式上的差异性,对差异型底物进行分子分析,鉴定出一类共有序列‘ATAA-N7-TTAT’,其为CcpC蛋白的识别位点。接下来,全基因组序列挖掘81个靶点,其中34.62%的靶点与cre基序差异碱基数目在3以内。最后,CcpC蛋白被鉴定为双向调节因子。(4)基于cre元件的CRISPRi-cre系统可以成功解除葡萄糖对木糖的CCR效应。首先,基于不同来源的Xyl R靶点构建了响应木糖的启动子元件。接下来,构建木糖响应型CRISPRi-cre系统,通过将sgRNA向导序列靶向木糖代谢关键基因中的3个cre位点,解除了葡萄糖对木糖的CCR效应,通过优化葡萄糖与木糖添加时间实现了51.46%的木糖与葡萄糖共代谢。B.licheniformis对碳底物具有明显的选择性,这是由CcpA蛋白所驱动的。在葡萄糖下,CcpA蛋白介导了CCR与CCA效应,这是由cre类型不同所致。基于CRISPRicre的靶向竞争cre位点是解除CCR效应的一种新型手段。