亚单位疫苗是新型动物疫苗的研究热点与开发方向。亚单位疫苗抗原通常是通过体外重组表达的病原体保护性功能蛋白,虽然安全性较高,但诱导的抗体水平有限,不足以对机体提供完全保护。提高亚单位疫苗抗原的免疫原性是新型动物疫苗开发中需要解决的关键问题。以纳米颗粒(Nanoparticles,NPs)为平台多价展示抗原是一种增强亚单位疫苗免疫原性进而诱导高水平机体免疫应答的有效策略,通过增加亲和力和颗粒大小来改善抗原呈递细胞(Antigen-presenting cells,APCs)摄取、淋巴结(Lymph nodes,LNs)转运和B细胞活化,已被成功用于临床研究和商业用途。猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2,PCV2)是重要的猪源病毒之一,引发严重的免疫抑制,且常混合或继发其他病毒感染,给世界养猪业造成重大损失。其衣壳蛋白(Capsid,Cap)能够自组装成病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs),是猪用亚单位疫苗开发中的理想抗原平台。本研究旨在开发一种基于PCV2 VLPs的通用型模块化纳米抗原展示平台。拟研究这种平台展示重要的猪源病毒保护性多肽、单体蛋白、二聚体蛋白和三聚体蛋白的潜能,并在小鼠模型中研究其诱导的免疫应答。本研究的主要内容以及所取得的结果简述如下:1.构建了Cap-Cat VLDisease pathologyPs纳米抗原展示平台为了实现便捷的装配方式,拓展PCV2 VLPs的更多应用,将PCV2 VLPs与模块化连接元件Spy Tag003/Spy Catcher003系统相结合,开发了Cap-Spy Catcher003(简称为Cap-Cat)VLPs纳米抗原展示平台。首先将Spy Catcher003基因序列融合到PCV2 Cap蛋白基因序列的C末端,构建了PCV2 Cap与Spy Catcher003融合蛋白的原核表达载体,然后利用大肠杆菌表达系统表达制备融合蛋白,采用硫酸铵沉淀和尺寸排阻色谱相结合的方式进行蛋白纯化。通过动态光散射(Dynamic light scattering,DLS)和透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)证实Cap-Cat VLPs可自组装成直径为20 nm的颗粒。稳定性和安全性评估结果显示,Cap-Cat VLPs具有良好的温度、冻融和储Fer-1分子量存稳定性:75℃孵育1 h后仍能保持溶解度、可抵抗10次冻融循环并在4°C下储存30 d以上。此外,Cap-Cat VLPs没有明显的细胞毒性,具有良好的生物相容性。2.Cap-Cat VLPs平台可有效展示不同大小和多聚体结构的猪源病毒保护性抗原为了评价Cap-Cat VLPs平台的抗原展示潜力,制备了4种具有不同大小和多聚体结构的Spy Tag003融合抗原,包括多肽形式的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)B细胞表位、单体形式的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)核心中和表位(Core neutralizing epitope,COE)蛋白、二聚体形式的经典猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白和三聚体形式的猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白。首先为了便于多种Spy Tag003融合抗原的纯化,同样通过NPs展示Spy Tag003蛋白,免疫小鼠后成功制备了抗Spy Tag003蛋白的高亲和力单克隆抗体。以该抗体为配体,利用亲和层析方法成功纯化了上述Spy Tag003融合抗原。SDS-PAGE结果显示,4种Spy Tag003融合抗原均能够在Cap-Cat VLPs平台上得较好的展示,其装配效率可达到约59%～91%,并保持了良好的溶解度。DLS和TEM分析结果表明,4种融合抗原结合VLPs后,粒径约为22～28 nm。3.Cap-Cat VLPs平台展示抗原可增强机体免疫应答为了研究4种抗原修饰的Cap-Cat VLPs的免疫原性,通过免疫接种小鼠分析机体体液和细胞免疫应答以及攻毒后的保护效力。结果表明,4种抗原修饰的Cap-Cat VLPs均诱导了高水平的免疫应答:与免疫接种的蛋白抗原相比,其血清中抗相应抗原的抗体滴度提高约6～8倍,病毒中和试验结果显示血清中中和抗体滴度提高约6～24倍。抗体亚型鉴定表明抗原修饰的Cap-Cat VLPs增强了Th2极化并改善了Th1极化。此外,与免疫相应蛋白抗原的小鼠相比,免疫几种抗原修饰的Cap-Cat VLPs的小鼠脾脏淋巴细胞中分泌细胞因子IFN-γ和IL-4的细胞数量增加约3.8～15.6倍,脾脏淋巴细胞刺激指数升高约1.2倍,脾脏淋巴细胞培养基中IFN-γ、IL-4和IL-2分泌水平增加约3.5～4.6倍,脾脏淋巴细胞中辅助性T细胞(T helper cell,Th)和细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)的比例提高约1.5～2倍。攻毒保护实验结果表明,Cap-Cat-HA VLPs能显著改善H1N1感染小鼠的肺部病理变化,并能将小鼠肺病毒滴度降低约400倍,将小鼠支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中炎性细胞因子TNF-α和IL-6分泌水平降低约18倍和13倍。此外,体内预存免疫对Cap-Cat VLPs免疫影响的分析显示,在体内已经存在高水平PCV2抗体或Cap-Cat支架抗体的情况下,Cap-Cat VLPs平台仍然可将所携带抗原的特异性抗体水平提高约3.2～8.5倍。4.Cap-Cat VLPs平台展示抗原增强机体免疫应答机理的初步研究本章以Cap-Cat-HA为代表,研究了Cap-Cat VLPs平台展示抗原改善树突状细胞(Dendritic cells,DCs)摄取、运输、LNs定位和免疫细胞激活的过程,初步分析了CapCat VLPs平台展示抗原增强机体免疫应答的机理。通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)和激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)证实了CapCat VLPs展示的抗原更容易被DCs摄取和内化,并有助于刺激DCs的活化与成熟;通过体内成像分析抗原在小鼠体内的转运动力学,结果表明Cap-Cat VLPs平台展示的抗原比蛋白抗原在体内的储存时间更长久,可在注射部位持续保留4 d以上,同时更有助于将抗原递送到次级免疫器官中;通过LNs冰冻切片的免疫荧光成像分析抗原在LNs中的累积和定位情况,结果表明Cap-Cat VLPs平台携带的抗原可在免疫后2 h到达LNs并能逐渐在滤泡树突状细胞(Follicular dendritic cell,FDCs)和生发中心(Germinal centers,GCs)区域内沉积,免疫后14 d淋巴结内FDCs和GCs区域的面积比免疫蛋白抗原增加了约2.1倍和3.3倍。最后通过FCM分析表明,使用Cap-Cat VLPs平台展示抗原能显著激活免疫细胞,将LNs GC B细胞和滤泡辅助T细胞(Follicular helper T,Tfh)比例分别提高约2倍和2.6倍Vorinostat分子量。综上所述,本研究构建了一种基于PCV2 VLPs的通用型纳米抗原展示平台,通过模块化装配方式成功展示了不同大小和多聚体结构的猪源病毒保护性抗原,并在小鼠体内引发了强大的体液免疫和细胞免疫应答。同时初步研究了增强机体免疫应答的潜在机理:适宜的尺寸与重复、高密度的抗原展示方式促进了DCs的摄取和抗原在LNs内的转运、定位和储存,并在FDCs和Tfh细胞的协助下启动GCs反应促进GC B细胞激活,进而诱导高效的免疫应答反应。总体而言,开发基于PCV2 VLPs的“即插即用型”通用纳米抗原展示平台能够为猪用亚单位疫苗抗原的颗粒化设计方式提供新的思路和技术支撑,有利于开发更加高效便捷的新型猪用亚单位疫苗,并为猪病毒性疾病的防控和鉴别诊断带来便利。