蓝细菌是目前已知最古老且唯一能进行光合放氧的原核生物,通过光合作用每年固定大气中约10%的二氧化碳,在全球碳循环、生物钟和生物演化等研究领域均具有重要研究价值。蓝细菌具有多种细胞形态,其生长与形态及生理功能等密切相关。蓝细菌细胞壁的结构组成特殊,因具有外膜结构被归为革兰氏阴性菌,但其肽聚糖层的结构特征却与革兰氏阳性菌更为相似。此外,蓝细菌还具有其自身独特的细胞壁合成调控机制。由于细胞结构的复杂性,关于蓝细菌如何在细胞生长和分裂过程中维持细胞形态,以及如何精准调控分裂过程中细胞壁形成的相关研究尚不成熟。细长聚球藻PCC 7942(Synechococcus elongatus PCC 7942,S.elongatus PCC 7942)是一种杆状单细胞蓝细菌,同时也是研究蓝细菌生理功能和形态发生的模式生物之一。本论文以细长聚球藻PCC 7942为研究对象,通过构建高通量蛋白标记体系,挖掘与其细胞形态发生相关的基因,从中鉴定到一个在蓝细菌中保守的未注释基因Synpcc7942＿RS00055,并证明该基因的编码蛋白在细长聚球藻PCC 7942的生长和分裂过程中具有重要的调控功能,属于一类新型细胞分裂调控蛋白。本文的主要研究内容具体如下:(1)细长聚球藻PCC 7942的高通量蛋白亚细胞定位技术的构建:基于Golden Gate法构建了适用于细长聚球藻PCC 7942的高通量克隆体系,通过引入cod A基因成功建立了细长聚球藻的高通量“无痕”蛋白荧光标记,并建立适用于细长聚球藻PCC 7942的显微成像方法。首先对96个基因进行了测试和高通量操作,实现了其中56个蛋白的亚细胞定位成像,对定位于不同细胞结构的蛋白进行了归属。在此基础上,筛选到一个定位于Z环附近,由未注释基因Synpcc7942＿RS00055编码的未知功能蛋白,我们将其命名为Ccd R(Cyanobacterial Cell Division Regulator),为进一步研究该蛋白的功能奠定了较好基础。(2)细长聚球藻中Ccd R蛋白的亚细胞定位分析与生理功能验证:通过在C端引入绿色荧光蛋白m Neon Green,对未注释功能蛋白Ccd R进行了荧光标记和显微成像,通过超高分辨显微镜和共聚焦激光显微镜,观察到Ccd R-m NG在细胞分裂中心Z环附近及细胞两极以点状存在。结合动态分析,发现细胞未发生分裂时,蛋白分散在细胞膜上;在细胞分裂过程中,蛋白快速运动聚集到细胞分裂中心。此外,Ccd R-m NG蛋白的表达水平还与细胞的生长周期有关,selleckchem Belumosudil当细胞处于对数生长期早期,蛋白表达水平高且定位于细胞分裂中心Z环附近;当细胞处于对数生长期后期或稳定期,蛋白的表达水平低且多处于细胞两极。综上,根据Ccd R蛋白的亚细胞定位特性,推测Ccd R可能与细胞的生长和分裂有关。(3)细长聚球藻中Ccd R蛋白的生理功能研究:利用生理遗传学手段,构建了细长聚球藻PCC 7942的ccd R基因缺失突变菌株(Δccd R),并进一步通过在该突变菌的NSI中性位点引入ccd R基因,得到回补菌株(Δccd R::ppsb A-ccd R)。生长曲线测试表明,Δccd R菌株的生长速率低于野生型菌株,回补株能够恢复菌株的生长水平。同时,Δccd Agricultural biomassR菌株的细胞形态发生明显变化,细胞直径变小,并形成纤维状细胞,这可能是细胞分裂但不分开导致。利用透射电子显微镜观察到Δccd R菌株的细胞分裂隔膜形成区与野生型不同,在回补株中观察到不对称的隔膜。综上,ccd R基因的敲除影响了细长聚球藻PCC 7942的生长分裂和细胞形态。(4Navitoclax体内)Ccd R蛋白与细长聚球藻PCC 7942中生长分裂相关蛋白的互作分析:在Ccd R蛋白C端标记FLAG标签,通过与Anti-FLAG抗体孵育,利用亲和层析-质谱技术鉴定到了与Ccd R特异性结合的28个蛋白,其中包括肽聚糖合成转肽酶Fts I和细胞杆状形态相关蛋白Rod Z等。利用细菌双杂交技术,对特异性结合蛋白和细胞分裂相关蛋白等17种蛋白进行互作分析,结果均为阴性,说明Ccd R蛋白和细胞分裂相关蛋白并没有直接的相互作用关系。(5)细长聚球藻PCC 7942中ccd R基因的调控机制分析:利用转录组学技术对Δccd R菌株及野生型菌株的基因表达水平进行分析比较,共鉴定到184个差异表达基因,其中76个基因的表达在缺失突变株中显著上调,108个基因显著下调。这些基因主要与类囊体膜结构组成及光合作用相关,并包含与细菌纤维素相关的基因bcs A等。进一步利用Ch IP-seq测序技术,获取了与Ccd R蛋白可能有相互作用的233个基因片段,通过和转录组数据的联合分析,共鉴定了19个相关基因,这些基因主要是和蛋白质的合成、基因转录及翻译相关。通过Peak-reads分析,预测到Ccd R蛋白最可能结合的Motif序列。通过微量热泳动技术,鉴定了Ch IP-seq中预测的Motif序列为Ccd R蛋白的特异性结合序列,综合以上分析,推测Ccd R是一个全局调控蛋白,和细菌的生长、分裂和肽聚糖层合成有关。(6)ccd R基因在大肠杆菌和毕氏酵母中的重组表达及其对细胞形态的调控:为阐明Ccd R蛋白调控细菌形态发生的普遍性规律,基于表达载体p ET-22b和p MY69,构建了包含ccd R基因的重组质粒,分别导入大肠杆菌BL21和毕氏酵母PPY12中进行重组表达,获得重组表达菌株。利用染料DAPI和FM4-64对大肠杆菌重组菌的染色质和细胞外膜结构进行染色和显微成像。构建了统计结果表明,过表达ccd R的菌株形态发生变化,出现大量圆形细胞,同时细胞直径显著变大。重组表达Ccd R蛋白的毕赤酵母细胞大小显著增加。由此,进一步证明了Ccd R蛋白在细胞形态维持方面具有普遍性调控作用。综上,本论文在构建高通量蛋白质亚细胞定位系统的基础上,鉴定到一个与细长聚球藻PCC 7942的细胞生长和分裂密切相关的未注释蛋白Ccd R,通过分子遗传学、荧光标记示踪及多组学技术,进一步阐明了Ccd R在细长聚球藻生长分裂中的生物学功能,并通过异源表达验证了该新型分裂相关蛋白普遍性参与杆状细菌的生长分裂和细胞形态调控的功能特性。