端粒位于异染色质的末端,是由一些简单的短DNA重复序列和特殊识别的蛋白质所组成。作为一种典型的异染色质结构,端粒在对于维持染色体稳定性和控制细胞分裂周期中起着重要作用。除此之外,端粒还在细胞响应DNA损伤以及延缓细胞衰老等方面也发挥着重要功能。研究发现,端粒长度以及结构在一定条件下会受到细胞代谢水平的调控。越来越多的研究成果表明,组蛋白翻译后修饰对于端粒沉默的调控也是至关重要的。作为一种非常重要的翻译后修饰,组蛋白H3苏氨酸11(H3T11)磷酸化调控许多重要的细胞生命过程。SESAME复合体中的丙酮酸激酶Pyk1催化的H3T11磷酸化(H3p T11)能够通过调节端粒沉默蛋白Sir2的表达来维持端粒沉默。在酿酒酵母中,丝氨酸/苏氨酸磷酸酶Glc7被鉴定出能够去H3T11磷酸化,然而对于磷酸酶Glc7在调控端粒沉默的研究上,更多的是其与端粒蛋白形成复合物作为催化亚基发挥作用,但Glc7是否受到其他修饰酶的调控以及如何发挥其磷酸酶的功能是未知的。端粒沉默受到多种翻译后修饰的调控,很多报道表明这些翻译后修饰是独立发挥作用的,然而,越来越多的研究表明,组蛋白翻译后修饰之间存在组合调控,也就是两个或者多个不同氨基酸上发生的修饰之间也能存在翻译后修饰之间的串扰,对于组蛋白H3p T11是否与其他翻译后修饰之间存在串扰并发挥功能还是鲜少见到的。我们用酿酒酵母作为研究对象,筛选与磷酸酶Glc7存在物理相互作用的其它修饰酶,研究这种存在相互作用的修饰酶以及其影响的组蛋白翻译后修饰之间的串扰在端粒异染色质调控中的功能。磷酸酶Glc7与乙酰转移酶SAS复合物存在物理相互作用,Sas2能够抑制Glc7与组蛋白的相互作用,使H3p T11水平降低。除此之外,我们分析Ch IP-sePD-0332991 NMRq发现组蛋白H3p T11与H4赖氨酸16(H4K16)乙酰化的分布呈现相反的趋势。Sas2能够调控Glc7与H3p T11在端粒以及自噬基因上的结合。总之,我们的研究为通过从调控修饰酶活性出发找寻修饰酶互作以及组蛋白翻译后修饰之间的串扰来动态调控端粒沉默与细胞自噬提供了重要的线索。具体研究结果如下:1.磷酸酶Glc7与乙酰转移酶Sas2存在物理相互作用。通过大量的免疫共沉淀筛选,我们找到了与Glc7存在相互作用的修饰酶Sas2。通过蛋白免疫沉淀Sas2检测Glc7和免疫沉淀Glc7检测Sas2,以及酵母细胞点平板实验,最终确定Glc7确实与Sas2存在相互作用。2.SAS复合物催化的H4K16乙酰化抑制H3T11磷酸化的表达。我们分析了Ch IP-seq数据,发现H4K16ac与H3p T11的分布呈现很强的负相关性。然后在突变体glc7-ts,以及H3T11A和H3T11D中检测了H4K16ac的表达,发现H4K16ac水平不变。之后在突变体sas2Δ、sas4Δ和sas5Δ中检测H3p T11,发现H3p T11水平明显升高,但Glc7的转录和蛋白水平都无明显变化。在乙酰化失活突变体H4K16A和H4K1此网站6R中同样观察到H3p T11水平显著升高。综上,我们发现SAS复合物催化的H4K16ac能够抑制H3p T11,但不影响与之相互作用的磷酸酶Glc7的水平。3.Sas2催化的H4K16ac促进Glc7与组蛋白的结合。我们纯化大肠杆菌表达的Glc7-HIS蛋白,在体外做组蛋白免疫共沉淀(HIP)实验,通过Western blots检测Glc7与组蛋白H3、H4、H2A和H2B之间的相互作用,发现在突变体sas2Δ和H4K16R中Glc7与组蛋白的结合明显降低,通过这种方式抑制H3p T11的水平。4.Sas2促进Glc7在自噬基因与端粒基因的结合。我们已经证明了Sas2与Glc7存在相互作用,并且H4K16ac和H3p T11的分布呈相反趋势,接着应用Ch IP-q PCR技术,在突变体sas2Δ中Ch IP:Glc7,我们发现Glc7在自噬基因与端粒基因上的结合都明显降低。说明Sas2能够特异性的招募Glc7结合到端粒基因上,从而破坏端粒沉默。5.Sas2抑Laboratory biomarkers制H3p T11在自噬基因与端粒基因的结合。Glc7是酵母中去H3T11磷酸化的磷酸酶,为了证明Sas2招募Glc7调控端粒沉默和自噬是不是通过其去磷酸化的功能来实现的,我们通过Ch IP-q PCR技术在突变体sas2Δ中检测了H3p T11在自噬基因和端粒基因上的结合,发现与Glc7结合相反,H3p T11在自噬基因和端粒基因上的结合下降。根据上述研究,我们的结果表明磷酸酶Glc7与乙酰转移酶SAS复合物存在相互作用;Sas2通过抑制Glc7与组蛋白的结合从而使H3p T11水平降低;并以端粒沉默与细胞自噬为切入点,对Sas2作为乙酰转移酶对磷酸酶Glc7的调控机制进行了研究,Sas2通过促进Glc7在自噬基因和端粒基因上的结合进而影响H3p T11来调控基因沉默,也表明了两种组蛋白翻译后修饰H4K16ac与H3p T11在端粒沉默调控过程中的串扰。总的来说,我们的研究发现了两种组蛋白修饰酶互作以及其影响的翻译后修饰之间的串扰在端粒异染色质调控以及细胞自噬中的作用。对调控H3T11磷酸化的机制进行研究对于端粒异染色质的调控进而延缓细胞衰老等都是极其重要的。