猪链球菌溶血素(Suilysin,Sly)是猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)的主要毒力因子,其在猪链球菌的致病过程中发挥关键作用。前期研究发现钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca~(2+)/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)是介导重组猪链球菌溶血素(Recombinant suilysin,rSly)细胞毒性的关键宿主因子之一,本研究旨在探究CaMKⅡ介导rSly诱导猪肾细胞(Porcine kidney-15,PK-15)凋亡的机制。一、rSly诱导PK-15细胞毒性的模型构建研究一是成功制备并鉴定了可溶性rSly。本研究以猪2型链球菌基因组DNA为模板,扩增出Sly毒力基因(1455 bp),通过构建p Cold I-Sly重组质粒,将其转入大肠杆菌BL21,18℃,180 r/min诱导表达24 h,经SDS-PAGE、Western blotting鉴定及溶血活性测定,制备了55 k Da的具有良好溶血活性的rSly。二是构建了rSly诱导PK-15细胞毒性的模型。将0、0.3、0.6、1.2、2.4和4.8μg/m L的rSly分别染毒PK-15细胞6、12及24 h,通过观察细胞形态、测定细胞存活Medicaid claims data率和LDH释放率,发现rSly毒性呈明显剂量效应。研究构建的rSly诱导PK-15细胞毒性的模型是:确定rSly对PK-15细胞染毒浓度是0.3和0.6μg/m L;确定rSly对PK-15细胞染毒处理时间为24 h;确定rSly对PK-15细胞染毒测定指标有:(1)细胞生长特点:细胞形态发生拉长、间隙增大;(2)细胞存活率:rSly染毒浓度为0.3和0.6μg/m L的细胞存活率分别为89.06%和53.06%;(3)LDH释放率:rSly染毒浓度为0.3和0.6μg/m L的LDH释放率分别为25.32%、33.61%。二、宿主蛋白CaMKⅡ介导rSly诱导PK-15细胞凋亡研究一是验证了CaMKⅡ介导rSly的细胞毒性作用。首先,用0.3和0.6μg/m L的rSly分别处理PK-15细胞24 h,Western blotting检测到rSly增加了CaMKⅡ磷酸化;其次,细胞形态学观察及细胞活力测定结果均显示,使用KN93抑制CaMKⅡ活性能显著减轻rSly诱导的细胞毒性,提高细胞存活率(P<0.01),说明CaMKⅡ介导了rSly诱导的ABT-199细胞培养细胞毒性作用;最后,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别在PK-15细胞上敲除编码CaMKⅡ四种亚型蛋白的CAMK2A、CAMK2B、CAMK2D、CAMK2G基因,rSly染毒4种基因敲除细胞,发现PK-15~(ΔCAMK2A)、PK-15~(ΔCAMK2B)细胞对rSly毒性的抵抗力增强,细胞存活率增加(P<0.01),揭示CaMKⅡ的α、β两种亚型在rSly诱导的细胞毒性中发挥主要作用。二是发现了CaMKⅡ可介导rSly诱导PK-15细胞凋亡。首先,通过测定凋亡、坏死性凋亡、自噬及焦亡的特征指标,发现rSly引起细胞死亡的主要途径为凋亡;其次,KN93抑制CaMKⅡ活性后,与rSly染毒正常PK-15细胞相比,AO-EB检测显示rSly诱导的细胞凋亡被抑制,且流式细胞术测定的细胞凋亡率降低了2.2倍,揭示CaMKⅡ可促进rSly诱导的PK-15细胞凋亡。三、宿主蛋白CaMKⅡ介导rSly诱导PK-15细胞的凋亡机制研究一是发现CaMKⅡ可介导rSly与细胞膜的结合。间接免疫荧光技术结果显示,抑制CaMKⅡ明显减少了rSly与PK-15细胞膜的结合。二是揭示CaMKⅡ可通过促进活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成从而促进rSly诱导的细胞凋亡。通过测定促凋亡因子ROS含量,结果显示抑制CaMKⅡ可显著减少rSly诱导的ROS生成(P<0.001),并利用ROS清除剂(N-aMK-2206配制cetyl-L-cysteine,NAC)预处理后显示NAC能够减少PK-15细胞凋亡,凋亡率降低了3.2倍,说明CaMKⅡ可通过促进ROS的生成从而促进rSly诱导的细胞凋亡。综上,本研究发现CaMKⅡ可促进rSly诱导的PK-15细胞凋亡,且CaMKⅡ是通过促进rSly与细胞膜结合以及ROS的生成来促进PK-15细胞的凋亡,这为今后继续深入阐明Sly的毒性机制提供了相应的理论依据。