前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是一种雄激素驱动的疾病,使用新型雄激素受体(androgen receptor,AR)抑制剂联合雄激素剥夺治疗可以获得明显的生存优势。尽管前列腺癌发展早期这种治疗手段能明显缓解病情,但几乎所有患者最终都会出现去势抵抗,对激素疗法产生耐药。多种基因组靶向药物、抗体偶联物和免疫疗法有望在未来改善前列腺癌患者的治疗现状。基因突变和免疫抑制是去势抵抗性前列腺癌(Castration-Resistant Prostate Cancer,CRPC)进展的重要原因。研究表明,约50%CRPC患者的磷酸酯酶与张力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)低表达。PTEN缺失可调控AR转录因子、激活PI3K/AKT通路,促进肿瘤生长。此外,炎症因子白介素23(interleukin-23,IL-23)是CRPC发展过程中的重要驱动因子。IL-23能够促进雄激素受体的转录和信号传导,并在维持前列腺癌细胞增殖方面起重要作用,间接促进去势抵抗性前列腺癌的发展。基于以上问题,Rapamycin采购本研究拟从基因治疗和免疫治疗两个方面考虑,制备递送效率良好的脂质纳米粒(Lipid nanoparticles,LNP)用于PTEN质粒的递送,以恢复PTEN的抑癌功能,同时使用IL-23抑制剂Apilimod阻断IL-23在CRPC进展中的驱动作用,二者协同发挥抗肿瘤作用,抑制CRPC的进展和转移。本研究构建了载PTEN质粒的脂质纳米粒(简称LNP@PTEN)并将其与IL-23抑制剂Apilimod组成联合治疗体系,以期从基因治疗和免疫治疗两个方面入手,延缓CRPC的发展进程,提高抗肿瘤疗效。本课题主要分为三个章节,第一章是脂质纳米粒的构建及表征。本章节我们通过迈克尔加成反应合成了脂质纳米粒的重要组成部分——阳离子脂质246C10。我们使用246C10、DSPC、β-谷甾醇和PEG_(2K)-DMG,通过自组装形成空白脂质纳米粒(简称LNP-Blank)。LNP-Blank为正电性纳米粒,可以与带负电的PTEN质粒通过静电吸附作用形成复合物LNP@PTEN。随后我们对所制备的脂质纳米粒进行了表征。空载的LNP-Blank粒径为(129.55±2.35)nm,Zeta电位为(29.7±1.4)m V。加入质粒形成LNP@PTEN后粒径增加至(131.8±3.1)nm,Zeta电位为(-2.35±0.75)m V。使用透射电子显微镜(Trbiotic elicitationansmission Electron Microscope,TEM)观察脂质纳米粒形态,LNP-Blank和LNP@PTEN均为类球形,且载PTEN质粒前后纳米粒形态没有出现明显变化。纳米粒可在20天内保持稳定,并通过琼脂糖电泳证明了脂质纳米粒对PTEN质粒的包载能力。第二章是联合治疗体系的体外研究,在细胞水平研究脂质纳米粒和抑制剂联合治疗体系的体外特征。首先对脂质纳米载体的毒性进行了考察,使用200μg/m L的LNP-Blank处理后的细胞活力良好,且细胞毒性远低于Lipo8000。流式细胞检测仪检测RM-1细胞对脂质纳米粒的摄取情况,并采用激光共聚焦检测摄取后的荧光分布。脂质纳米粒被RM-1细胞成功摄取,EGFP质粒表达的绿色荧光蛋白在细胞质中被观察到。使用EGFP质粒代替PTEN质粒进行核酸转染实验,通过设置不同的LNP/EGFP质粒质量比,确定了当质量比为7时,脂质纳米粒的转染效果最好。LNP@EGFP在拥有比Lipo8000更好的转染效率的同时显示出较Lipo8000更低的细胞死亡率。最后,对联合药物治疗体系的体外抗侵袭转移能力进行了考察。Apilimod组和LNP@PTEN组均表现出一定的抗侵袭转移效果,且二者表现出协同作用,联合治疗组具有较单药组更强的抗侵袭转移能力。第三章是联合治疗体系的抗去势抵抗性前列腺癌体内研究,对治疗体系的体内安全性、抗肿瘤效果等方面进行了考察。构建了C57BL/6J小鼠CRPC骨转移动物模型。采用小动物活体成像技术记录24 h内的药物体内分布情况,检测到LNP@DIR在肿瘤部位出现明显的荧光聚集。对Apilimod+LNP@PTEN的体内抑瘤作用进行考察,通过肿瘤体积生长变化情况、小鼠生存期等评价了联合治疗体系的抗肿瘤作用,证实了联合治疗具有协同作用,能够明显缓解肿瘤进展,延长小鼠生存期。另外,从组织切片HE染色、血生化指标检测等方面证明了联合治疗体系有良好的生物安全性。对Apilimod+LNP@PTEN的免疫调节机制进行了考察,结果显示联合治疗提高了CD8~+/CD4~+T的比例、减少了抑制性免疫细胞MDSCs的比例。最后,通过微计算机断层扫描技术(Micro computed tomography,Nirogacestat临床试验Micro CT)分析证实了PTEN质粒和IL-23抑制剂Apilimod的联合治疗对骨代谢的保护作用。本研究构建了脂质纳米粒LNP@PTEN,并将其与IL-23抑制剂Apilimod联合用于CRPC治疗。该脂质纳米粒可以利用EPR效应聚集于肿瘤部位,将PTEN质粒运送至肿瘤部位并释放在肿瘤细胞内,恢复PTEN的抑瘤功能。LNP@PTEN与Apilimod的联合使用可以从基因治疗与免疫治疗两方面协同治疗CRPC,抑制其进展和转移。本研究验证了两种药物具有良好的协同治疗效果,与单一用药相比显示出更加明显的肿瘤抑制作用。因此,这项研究可以为CRPC的治疗提供新策略。