目的:本研究通过基因编辑技术构建B细胞缺失小鼠模型(hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO mice),并通过体内及体外实验对构建的小鼠模型进行验证,以期建立不发生大分子生物药免疫原性的动物模型,为抗体类药物候选分子的筛选及临床前的药效评价研究等提供高效合理的动物模型。方法:1.采用基因编辑技术构建Bcancer – see oncology细胞selleckchem RSL3缺失小鼠模型。2.采用PCR法检测子代小鼠基因型,以确定子代小鼠是否为目标小鼠;采用流式细胞术分析小鼠脾、骨髓细胞中Ig M及Ig D蛋白表达情况,以确定构建的小鼠体内B细胞是否缺失。3.采用流式细胞术分析小鼠脾、外周血及淋巴结中白细胞亚群及T细胞亚群变化情况,以评估B细胞缺失对小鼠各淋巴细胞亚群分布的影响。4.通过流式细胞仪分析hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠的脾脏和外周血中的颗粒酶B、γ干扰素和增殖指数Ki-67的水平,以评估hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠是否影响小鼠体内的NK细胞及T细胞的增殖与激活。5.建立MC38结肠癌小鼠模型,采用腹腔注射的给药方式,分别给hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO荷瘤小鼠以及B细胞功能正常的hPD-1/hPD-L1荷瘤小鼠腹腔注射M7824,观察两种小鼠肿瘤体积及体重的变化情况。6.采用Elisa法检测小鼠血清中M7824类似物和抗M7824类似物抗体水平,以评估B细胞缺失小鼠是否能避免M7824的免疫原性影响,同时显示出M7824的抗肿瘤效应。结果:1.PCR结果显示:与野生型C57BL/6小鼠相比,hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠中仅能检测到人PD-1、人PD-L1以及Igh-J,鼠PD-1及鼠PD-L1检测不到。2.流式细胞术结果显示:(1)野生型C57BL/6小鼠可检测到小鼠Ig M和Ig D,但在hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠中检测不到。(2)野生型C57BL/6小鼠仅可检测到鼠PD-1,hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠中仅可检测到人PD-1。(3)野生型C57BL/6小鼠仅可检测到鼠PD-L1,hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠中仅可检测到人PD-L1。3.流式细胞术结果显示:(1)脾脏白细胞亚群分析发现,hPD-1/hPD-L1,IghJ KO小鼠B细胞发育失败,导致该小鼠B细胞缺失,T细胞、粒性白细胞和单核细胞所占比例显著增加(P(27)0.001),其他细胞如树突状细胞、巨噬细胞等由于细胞含量较少,未检测到细胞比例变化情况。(2)脾脏T细胞亚群分析发现,hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠的CD8+T细胞百分率、CD4+T细胞百分率、调节性T细胞百分率与C57BL/6小鼠相似,未有明显改变。(3)在淋巴结和血液中得到类似的结果。4.流式细胞术结果显示:(1)与未接受聚肌苷酸胞苷酸的小鼠相比,经聚肌苷酸胞苷酸刺激后的hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠及hPD-1/hPD-L1小鼠中,其外周血及脾细胞中NK细胞分泌的颗粒酶B以及γ干扰素水平显著升高(P(27)0.01)。(2)与未接受抗CD3ε抗体刺激的小鼠相比,经抗CD3ε抗体刺激后的hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO小鼠及hPD-1/hPD-L1小鼠中,其脾细胞中CD4+T细胞及CD8+T细胞分泌的颗粒酶B、γ干扰素及Ki-67水平显著升高(P<0.01)。5.体内药效实验结果显示:(1)相同给药条件下,与B细胞功能正常的hPD-1/hPD-L1荷瘤小鼠相比,M7824在hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO荷瘤小鼠中显示出显著的抗肿瘤效果(TGI=69.2%),而M7824在hPD-1/hPD-L1荷瘤小鼠上未显示出抗肿瘤效果。(2)与对照组相比,hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO荷瘤小鼠在给药前后体重变化与B细胞功能正常的hPD-1/hPD-L1荷瘤小鼠保持一致,无明显差异。6.体外检测结果显示:(1)在hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO荷瘤小鼠中,能够检测到血清M7824类似物,且血药浓度随着给药次数增加而增加,同时小RP56976采购鼠血清中未检测到抗M7824类似物抗体。(2)hPD-1/hPD-L1荷瘤小鼠在给药第10天后,不能检测到血清M7824类似物,且所有小鼠血清在第6天均能够检测到抗M7824类似物抗体。结论:1.B细胞缺失小鼠(hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO mice)可用作肿瘤免疫药物的有效筛选动物模型,其保留了用于免疫治疗评估的重要免疫细胞类型,同时不会对抗药物抗体产生过敏反应。2.B细胞缺失小鼠(hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO mice)仅B细胞缺失,而小鼠体内的NK细胞及T细胞的增殖和激活未受到影响,因此该小鼠模型可用于NK细胞及T细胞相关的免疫疗法的研究。3.B细胞缺失小鼠(hPD-1/hPD-L1,Igh-J KO mice)模型可以有效降低甚至避免免疫原性的产生,可为抗体药物的筛选及药效评价等研究提供帮助。