目的:对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)因其镇痛和解热特性成为临床上解热镇痛最常用的药物之一,其在推荐剂量下是安全有效的,而过量使用可能导致肝毒性和急性肝功能衰竭(Acute liver failure,ALF)。n-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC),一种已知的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)清除剂,被美国食品和药物管理局推荐作为唯一一种有效的临床治疗APAP诱导的急性肝损伤的药物;然而这种药物有明显的局限性,副作用明显、治疗窗口狭窄。因此,需要开发在有效性和治疗时间框架方面优于NAC的新药。大量研究表明,APAP诱导的肝细胞坏死常伴有炎症,人参皂苷Rc(Ginsenoside Rc)作为人参中最具代表性的特异性生物标志物之一,具有良好的抗氧化应激、抗炎症、神经保护及调节糖脂代谢和护肝等生物活性作用,但对于对乙酰氨基酚过量导致急性肝损伤的治疗作用尚不明晰。因此本研究以肝脏代谢调控的关键靶点FXR(Farnesoid X Receptor)核受体为基础,进一步研究对乙酰氨基酚诱导的急性肝细胞损伤、氧化应激和炎症反应,以及FXR对APAP诱导的急性肝损伤的保护作用。方法:1.WT(Wild Type)小鼠及原代肝细胞验证人参皂苷Rc对于APAP诱导肝损伤分子作用机制在C57BL/6的小鼠原代肝细胞以及小鼠体内体外建立APAP急性肝损伤模型并且给药。小鼠肝脏原代肝细胞分为5组(n=4):Control组、模型组(APAP)、人参皂苷Rc+APAP组(Rc 50μM)、人参皂苷Rc+APAP组(Rc 25μM)、人参皂苷Rc+APAP组(Rc 12.5μM)组,各给药组及损伤模型组分别加入10m M APAP,空白对照组加入等体积DMSO溶媒,诱导24h。小鼠模型通过选取SPF级雄性C57BL/6小鼠随机分为4组(n=8),包括正常对照组、APAP(300mg/kg)肝损伤造模型组、APAP(300mg/kg)+Rc低剂量组(5mg/kg/d)、APAP(300mg/kg)+Rc高剂量组(10mg/kg/d)。各组按照剂量给予人参皂苷Rc腹腔注射给药,正常对照组给予等体积生理盐水。连续给药10d,每天1次。配置浓度为30mg/ml的APAP标准注射液,用l ml注射器迅速吸取标准液注射小鼠腹腔,除正常对照组外,其余各组小鼠腹腔注射APAP(300mg/kg)诱发小鼠急性肝损伤。对照组按照体重给予等容量的生理盐水。用q PCR、Western Blotting、ELISA和免疫荧光等方法检测肝细胞中和APAP代谢、凋亡、氧化、炎症等相关基因的表达变化,试剂盒检测肝细胞/肝脏中ALT、AST等肝损指标,HE染色检测肝组织形态中的变化情况,以TUNEL法检测肝细胞凋亡状态,GSH和SOD试剂盒检测小鼠肝脏抗氧化的表达情况。2.探讨FXR(Nrlh4)敲除小鼠及原代肝细胞验证Rc对于APAP诱导肝损伤作用机制利用分子对接验证人参皂苷Rc是否能和FXR对接,在FXR~(-/-)小鼠原代肝细胞以及FXR~(-/-)小鼠上建立APAP急性肝损伤模型并且给药Medical countermeasures。FXR~(-/-)小鼠肝脏原代肝细胞分为3组(n=4):Control组、模型组(APAP)、人参皂苷Rc+APAP组(Rc 50μM),各给药组及损伤模型组分别加入10m M APAP,空白对照组加入等体积DMSO溶媒,诱导24h后,进行下一步实验。FXR基因敲除小鼠随机分为3组(n=8),包括正常对照组、APAP(300mg/kg)肝损伤造模型组、APAP(300mg/kg)+Rc组(10mg/kg/d)。各组按照剂量给予人参皂苷Rc腹腔注射给药,正常对照组给予等体积生理盐水。连续给药10d,每天1次。配置浓度为30mg/ml的APAP标准注射液,用l ml注射器迅速吸取标准液注射小鼠腹腔,除正常对照组外,其余各组小鼠腹腔注射APAP(300mg/kg)诱发小鼠急性肝损伤。对照组按照体重给予等容量的生理盐水。用qPCR、Western Blotting、ELISA和免疫荧光等方法检测肝细胞/肝脏中和APAP代谢、凋亡、氧化、炎症等相关基因的表达变化,试剂盒检测肝细胞中ALT、AST等肝损指标,HE染色检测肝组织形态中的变化情况,以TUNEL法检测肝细胞凋亡状态,GSH和SOD试剂盒检测小鼠肝脏抗氧化的表达情况。比较各组间差异并进一步验证Rc肝保护作用PLX5622分子量通路。结果:1.小鼠肝脏原代细胞中,人参皂苷Rc处AZD1152-HQPA理有效地改善了APAP诱导的炎症和ROS的产生,缓解了APAP诱导的小鼠肝脏原代细胞MPHs细胞凋亡和NAPQI的积累。Western blotting结果显示APAP模型组中,细胞凋亡基因Bcl2/Bax m RNA相对表达水平是上调的,人参皂苷Rc处理可以逆转Bcl2/Bax m RNA相对表达水平。人参皂苷Rc处理后TUNEL染色比较损伤模型组红色荧光标记阳性凋亡细胞数量明显减少。2.在APAP急性肝损伤模型的小鼠中,人参皂苷Rc的给药明显减弱了肝脏毒性,表现为给药组小鼠存活率的提高和肝脏功能障碍的修复。(1)ALT、AST试剂盒结果显示人参皂苷Rc给药后血清ALT和AST水平显著降低,肝脏损伤程度显著降低。(2)HE染色显示,人参皂苷Rc给药后肝脏坏死区域明显减少,明显改善了肝细胞的凋亡。(3)GSH试剂盒显示Rc处理增强了GSH血清水平的表达,m RNA显示增强了抗氧化基因的表达。3.人参皂苷Rc可以上调WT小鼠肝脏原代细胞以及WT小鼠中FXR的m RNA表达;结合分子对接以及KEGG结果表明,人参皂苷Rc可能通过介导FXR蛋白来发挥相关作用。FXR敲除后,人参皂苷Rc对于APAP诱导的炎症反应、细胞凋亡及氧化应激失去保护作用;人参皂苷对FXR~(-/-)MPHs细胞失去抗炎抗氧化的调控作用。结论:从人参中分离得到的化合物人参皂苷Rc可以改善APAP诱导小鼠肝脏及其原代细胞的细胞凋亡,并改善其氧化应激状态,减轻炎症。同时,人参皂苷Rc通过FXR核受体激活依赖性地发挥对APAP诱导肝损伤的保护作用。人参皂苷Rc对肝脏的保护作用因FXR的敲除而失去作用,推测人参皂苷Rc可能是通过介导FXR来发挥上述作用。