近年来,核酸等温循环反应因其具有设备要求低、检测速度快、选择性好、稳定且高效的特点,受到研究者们的广泛关注。基于荧光分析法构建的荧光信号扩增技术,具有检测灵敏度高、操作简便、需样量少等一系列优点,已成为一种重要的科学研究手段,在生物医药、疾病诊断、环境监测与污染防治等方面应用广泛。然而,传统的荧光信号扩增技术往往依赖于荧光材料自身的发光性质来实现信号扩增,仅能用于常量目标物的分析检测,限制其在生化传感分析中的应用。此外,荧光信号扩增技术中绝大多数荧光材料还具有生物相容性好的特点,可以与核酸等温循环反应相结合,有效避免了传统荧光信号扩增技术灵敏度有限的缺点,同时扩大其应用范围,在多领域有广泛应用,如细胞成像、多种靶标物质的检测、生物医药以及癌症的早期诊断和防治。基于此,本论文主要研究工作如下:1.酶促循环扩增反应耦合DNA模板纳米铜信号输出的汞离子传感基于目标触发的等温循环反应和DNA模板化纳米铜(Cu NPs)的无标记信号输出,本工作成功构建了一种用于Hg~(2+)超灵敏均相检测的新型荧光传感器。该传感器通过ExoⅢ辅助的目标循环信号放大反应诱导发夹底物发生构型转变,形成Cu NPs的合成模板,再利用抗坏血酸对Cu~(2+)的还原作用得到Cu NPs,产生荧光信号。在优化条件下,该传感策略在10 p M到1.0μM线性范围内,实现对Hg~(2+)的精准检测,检测限低至3.9 p M。该传感策略在实际水样中具有较高的稳定性和和较好的抗干扰能力,成功用于实际水样中Hg~(2+)的检测。此外,Cu NPs对模板的高度依赖性和T-Hg~(2+)-T结构的特异性识别功能,使得本工作所构建的传感器Pulmonary infection显示出较高的灵敏度和较好的选择性。2.闭合循环DNA机器的构建及其分子逻辑运算应用基于杂交链式反应(HCR)和催化发夹组装(CHA)双向激活的闭环等温循环反应,本工作设计了一种灵敏度高、特异性好、操作简便、无酶参与的DNA机器,可以用于简单、易于编程的FUT-175 NMR高灵敏分子逻辑运算。一旦触发启动因子,DNA机器就会连续全封闭循环运行,实现信号指数扩增。通过对输入元件和计算元件的合理设计,利用DNA机器构建了多种简单方便的逻辑门:OR、AND、NOR、YES、NAND、INHIBIT。另外,本工作通过对OR逻辑门输入信号浓度的改变来验证DNA机器的信号扩增效果,结果表明,HCR与CHA的协同作用可以加速信号放大,实现“弱输入-强输出”的信号扩增。3.闭合循环DNA机器用于APE1高灵敏均相检测本工作通过将目标识别模块与DNA机器中的闭合循环回路(CCC)结合,构建了一种可以用于癌症标志物APE1均相灵敏检测的生物传感平台。APE1首先特异性识别并裂解APE1探针,释放DNA机器的启动子T1,进而引发HCR中末端标记FAM和TAMRA的发夹DNA发生荧光共振能量转移,产生显著的荧光信号。同时,HCR产物可以引发CHA,得到与引发剂T1序列相同的T1类似物,反向触发HCR,再次启动DNA机器,形成闭合循环回路。通过HCR和CHA系统之间的自催化反馈循环产生指数放大的荧光信号,实现细胞内APE1的高灵敏和特异性检测。在优化条件下,DNA机器在0.0001到1.0 U/m L线性范围内,实现对APE1的精准检测,检测限低至0.078 U/L。该方法还成功用于实际人体细胞裂解液中APE1的检测,并能清晰区分癌细胞和正常细胞中APE1的浓度水平Z-IETD-FMK分子量。因此,通过将目标识别模块与CCC模块集成,DNA机器可以精准识别目标物,应用于细胞内APE1的高灵敏检测。