新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)所引发的急性、烈性传染病,可感染多种禽类和鸟类,对鸡的发病率和死亡率可高达100%,对全世界的养禽业造成了极大危害。NDV为不分节段的单股负链RNA病毒,属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、禽副黏病毒亚科(Avulavirinae)、正禽副黏病毒属(Orthoavulavirus)。许多单股负链RNA病毒感染宿主细胞后会形成无膜的细胞内区室,被称为病毒包涵体(inclusion bodies,IBs)、病毒工厂(viral factories,VFs)或病毒体(viroplasms),通常认为IBs是病毒复制的关键位点。目前关于NDV IBs的研究仍为空白,本研究利用免疫荧光染色、活细胞成像Taurine使用方法及光漂白后荧光恢复(Fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)等技术对NDV IBs的形成及形成机制进行了初步探索,具体的研究内容及结果如下:1.以NP蛋白为标志物,分析NDV感染后包涵体类似结构的形成及其与病毒感染时间的关系,结果表明NDV感染细胞后12h,细胞质中开始出现球形的包涵体类似结构,随着感染时间的增加,包涵体类似结构的体积由小变大,形状由球形变为不规则形。为了探究包涵体类似结构中是否含有新合成的病毒RNA,本研究利用actinomycin D(Act D)抑制细胞RNA的合成(不影响病毒RNA的合成),在包涵体类似结构中检测到了EU标记的新合成的病毒RNA。通过透射电子显微镜对包涵体类似结构的观察结果显示,包涵体类似结构为具有高电子密度的无膜球形结构。以上结果证明NDV感染形成的球形结构在extramedullary disease形态、成分和超微结构方面与单股负链RNA病毒IBs的特征相似,因此确定NDV感染DF-1细胞后能够形成IBs。2.NDV感染细胞所产生的IBs具有高电子密度,且小体积的IBs似乎能够互相融合形成大体积的球形IBs,暗示NDV IBs可能具有液-液相分离(LLPS)的特性,目前鉴定一个结构是否具有LLPS特性的标准为形状呈规则的球形、可以相互融合、能与周围环境进行物质交换。本研究构建EGFP被标记到NP蛋白N端(EGFP-NP)及C端(NP-EGFP)的真核表达载体,通过免疫荧光染色和激光共聚焦试验验证,NP-EGFP可与NDV IBs在细胞内共定位,因此将其作为NDV IBs的标记来追踪NDV IBs的动态。NP-EGFP转染DF-1细胞后感染NDV,活细胞成像结果表明IBs能够互相融合;利用光漂白后荧光恢复对NP-EGFP的荧光信号进行光漂白,荧光信号可迅速恢复,证明NDV IBs能够与周围环境进行物质交换;使用LLPS抑制剂1,6-己二醇处理NDV感染的细胞,NDVNirogacestat试剂 IBs被迅速破坏。以上结果表明,NDV IBs是通过液-液相分离途径形成的。3.NDV NP蛋白、P蛋白、L蛋白对病毒RNA的合成起着重要作用。本研究将NP蛋白、P蛋白和L蛋白在DF-1细胞中单独表达或组合表达。结果显示,NP蛋白和P蛋白的共表达即可形成NDV包涵体类似结构。为了确定NP蛋白和P蛋白介导包涵体类似结构形成的具体结构域,本研究根据NP蛋白和P蛋白的功能域分别构建NP蛋白和P蛋白的截短体,通过共表达、免疫荧光染色和免疫共沉淀,确定了NP蛋白的N端结构域和P蛋白的C端结构域是介导包涵体类似结构形成的关键区域。此外,由于P蛋白是一种高度磷酸化的蛋白,蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)介导的磷酸化在NDV的生命周期中发挥重要作用,因此对PKC是否在NDV IBs形成中发挥作用进行了研究。分别使用staurosporine(PKC抑制剂)和PMA(PKC激动剂)处理NDV感染的细胞,结果显示staurosporine处理可显著减小IBs的体积,且病毒滴度和病毒蛋白表达量呈剂量依赖降低;PMA处理对IBs的大小无显著影响,但可拮抗staurosporine对IBs的大小、病毒滴度及病毒蛋白表达量的抑制作用。这些结果表明PKC能够影响NDV IBs的形成和NDV的增殖。4.一些RNA病毒能够利用内质网、高尔基体和微管等细胞器促进病毒的增殖,因此本研究对NDV IBs与内质网、高尔基体和微管的关系进行了探究。结果发现,NDV IBs位于内质网和高尔基体附近;分别用抑制剂破坏内质网、高尔基体和微管的结构,NDV IBs的体积明显减小,NDV病毒滴度及病毒蛋白表达量明显降低,其增殖能力也受到抑制。因此,内质网、高尔基体和微管能够促进NDV IBs形成和NDV增殖。综上,本研究证明了NDV感染DF-1细胞后能够通过液-液相分离途径形成IBs,IBs是具有高电子密度的无膜结构,包含新合成的病毒RNA。NP蛋白和P蛋白是形成包涵体类似结构的最小病毒组分,其中NP蛋白N端区域和P蛋白的C端区域在包涵体类似结构形成中发挥着关键作用。PKC可以影响IBs形成和NDV增殖。此外,内质网、高尔基体和微管能够促进NDV IBs形成和NDV增殖。