抗生素的大量及不规范使用使得细菌耐药日趋严峻。噬菌体被认为是治疗耐药菌感染的有力武器之一。然而噬菌体治疗一直受限于噬菌体裂解谱较窄。在细菌与噬菌体不断相互斗争和进化的过程中,细菌演化出许许多多的防御系统,由此我们猜想可能是细菌中的防御系统导致噬菌体的宿主谱较窄。Toll-like受体最初是通过其在胚胎发育过程中的背腹模式中发挥的作用被识别出来的,后来被认为与果蝇的免疫反应有关。有研究发现细菌的TIR结构域蛋白决定了对入侵病原体的防御特性及免疫特异性。本研究用大肠杆selleck抑制剂菌中TIR防御系统压力下定向进化噬菌体的方法,筛选出能耐受该系统的噬菌体,从而得到一种能高效筛选耐受TIR防御系统获得广谱噬菌体的新途径。同时揭示Fecal microbiome宿主菌防御和噬菌体的反防御机制,为解决噬菌体治疗中宿主谱窄的问题,提供理论依据。研究主要内容如下:1.三种大肠杆菌新型TIR防御系统的研究本研究以实验室大肠杆菌基因组为模板克隆出45、67、70号3种含有TIR结构域的候选防御系统,成功构建了3种表达TIR防御系统的质粒。用Thttps://www.selleck.cn/products/Gefitinib.html4和T7噬菌体检验3种TIR防御系统的防御效果,结果可见67号防御系统可以抵御野生型T7噬菌体,3种防御系统均可以不同程度的地抵御野生型T4噬菌体。为了进一步验证这3种防御系统是否具有普遍的防御效果,用实验室分离的111株噬菌体,验证其防御系统的抗病毒活性。结果表明,45号系统能够抑制28种噬菌体,67号系统能够抑制30种噬菌体,70号系统能够抑制15种噬菌体。以上结果说明这3种防御系统对模式噬菌体和环境中分离的噬菌体均具有较广泛的防御活性。为探究3种TIR防御系统是否通过流产机制对噬菌体进行防御,本研究利用噬菌体裂解细菌的生长曲线试验,含有3种防御系统的大肠杆菌中分别加入不同剂量的T4噬菌体,读取细菌生长过程的OD_(600)值。结果发现,3种TIR防御系统对T4噬菌体均是通过流产感染机制发挥抗病毒作用。2.耐受TIR防御系统噬菌体的筛选噬菌体在含有防御系统的菌中会因为生存压力而不断进化,理论上噬菌体为了生存就会通过自身突变逃避防御系统的抵御。本试验用高剂量的噬菌体在含有TIR系统大肠杆菌的双层琼脂平板上进行点斑,分别对被67号TIR系统防御的T7噬菌体,被70和45号系统防御的T4噬菌体进行耐受噬菌体的筛选。在67、70和45号TIR防御系统菌株压力下分别经过8代、10代和15代的传代筛选,我们获得了相对应的耐受型T7噬菌体突变体和耐受型T4噬菌体突变体。为了验证耐受防御系统的T4和T7突变体的宿主谱是否变广,试验利用41株致病性大肠杆菌作为宿主菌,对耐受T4和T7模式突变体进行宿主谱检验。我们发现,T7噬菌体原本不能侵染41株致病性大肠杆菌,而耐受后的T7能够对其中的15株有不同程度的裂解。T4噬菌体能够侵染41株致病性大肠杆菌中的4株,而耐受后的T4突变体能够侵染其中的21株。这些结果证实,可以通过筛选耐受防御系统的噬菌体拓宽噬菌体的裂解谱。为了寻找到噬菌体耐受TIR防御系统的具体基因和突变位点,我们提取了筛选前后的噬菌体基因组并进行测序和分析,发现在T7噬菌体的基因A上有两个突变位点,基因B上有一个突变位点。利用噬菌体基因编辑技术对野生型噬菌体进行改造,得到基因A的单位点和双位点突变,基因B单位点的4种T7突变体。点斑验证发现,只有基因A的双位点突变才能获得对TIR防御系统的逃逸。实验室从环境中分离了4株大肠杆菌噬菌体,为了拓宽其的宿主谱,我们筛选了耐受多重防御系统的广谱性噬菌体。试验采用课题组构建的13种候选TIR防御系统对环境中分离的4株大肠杆菌噬菌体进行点斑观察,根据防御图谱结果可知其中EP66 phage和EP133 phage能够被大多数TIR防御系统防御。试验重点对这两株噬菌体进行耐受多重防御系统的筛选,经过25代和30代反复的筛选,我们获得了2株广泛耐受的突变体,其中EP66 mutant能够耐受6种TIR防御系统,EP133 mutant能够耐受9种TIR防御系统。进一步检验这两株噬菌体突变前后的宿主谱变化,结果发现,耐突多重TIR的EP66 mutant和EP66Phage野生型相比,能多裂解24株致病性大肠杆菌;耐突多重TIR的EP133mutant和EP133 Phage野生型相比,能多裂解20株致病性大肠杆菌。3.突变噬菌体的生物学特征分析和杀菌能力评估为了判断突变前后环境中分离的噬菌体的生物特性是否变化,我们对其进行了耐热、耐酸碱、体外增殖和裂解能力检测。结果可知,环境中分离噬菌体EP 133和EP 66 phage在突变后与突变前相比耐热、耐酸碱和体外裂解能力上有不同程度的增强。另外,为检验进化后噬菌体是否具备临床应用的条件,在牛奶中进行杀菌效果评估,结果突变后与突变前鸡尾酒杀菌效果相比差异显著(p<0.05)。本研究发现并验证了3种大肠杆菌新型TIR防御系统,并证实它们均通过流产机制发挥较广泛的抗噬菌体活性。同时利用噬菌体在TIR防御系统的压力下定向进化的方法,筛选出了能耐受TIR系统的T4和T7突变体和耐受多重TIR的EP66 mutant和EP133 mutant。耐受后的突变噬菌体裂解谱均变广,这对畜牧生产行业多重耐药菌治疗有一定的应用前景。