玉米作为我国播种面积最大的粮食作物,在保障粮食安全方面具有重要地位。近年来玉米种子库存积压严重,抗老化能力直接影响种子的贮藏年限。因此,挖掘抗老化关键基因并解析其调控机制,进而培育耐贮玉米新品种是解决以上问题的有效途径。本文利用实验室前期创制的zmmyb59功能缺失突变体,研究Zm MYB59转录因子在玉米种子抗老化中的功能,通过RNA-Seq、CUT&Tag、双荧光报告系统、EMSA等组学和分子生物学实验探究Zm MYB59在转录水平调控种子抗老化能力的分子机制。主要研究结果如下:(1)Zm MYB59转录因子正调控玉米种子的抗老化功能。本文利用实验室前期通过基因编辑技术获得并已鉴定的zmmyb59功能缺失突变体,在人工老化处理4天后进行发芽试验,结果表明未老selleck化学化处理的突变体和野生型的发芽率没有显著差异,但突变体的根长和芽长都显著长于野生型;老化处理显著降低了zmmyb59突变体的发芽率、根长和芽长,zmmyb59-1的发芽率、根长和芽长较野生型分别降低20.0%、24.0%、32.0%,zmmyb59-2的发芽率、根长和芽长较野生型分别降低23.0%、27.2%、34.3%。以上结果说明Zm MYB59转录因子可能正调控玉米种子的抗老化能力。(2)Zm MYB59转录因子直接结合Zm ICDH1启动子上的AC元件调控其表达。通过联合分析Zm MYB59过表达原生质体的RNA-Seq和CUT&Tag数据,并根据查阅文献和基因功能区域特征的注释,进一步筛选到3个候选基因。在玉米原生质体中,利用双荧光报告系统对候选基因启动子活性进行鉴定,发现其中一个候选基因(Zm ICDH1)启动子活性受Zm MYB59影响上调29.3倍。对Zm ICDH1启动子进行顺式作用元件预测,发现其启动子上存在2个AC元件。为明确所预测元件的功能,我们根据Zm ICDH1启动子上AC元件的位置分别构建不同长度的双荧光报告载体,并分别与Zm MYB59或GFP过表达载体共转入玉米原生质体,最终发现位于起始密码子上游-176 bp的第二个AC元件具有功能。进一步将该元件突变后,发现Zm MYB59对其调控倍数大幅度下降,表明Zm MYB59能够结合位于Zm ICDH1启动子区域的第二个AC元件调控该基因的表达。同时使用纯化后的Zm MYB59蛋白和用生物素标记的含AC元件探针进行EMSA实验,发现Zm MYB59可以结合在Zm ICDH1启动子区域已鉴定的AC元件上PI3K/Akt/mTOR抑制剂。(3)Zm ICDH1在玉米种子抗老化中的功能探究。通过检测Zm MYB59和Zm ICDH1在B73玉米种子发育过程中的表达量,发现Zm MYB59先于Zm ICDH1开始表达,说明Zm MYB59表达量的积累可能促使Zm ICDH1表达,即Zm MYB59可能通过调控Zm ICDH1的表达影响种子抗老化能力。对Zm ICDH1进行亚细胞定位,发现Evolution of viral infections其定位在细胞质中。通过对Zm ICDH1原核表达蛋白的酶活性进行测定,发现该蛋白具有异柠檬酸脱氢酶活性。由于细胞质中异柠檬酸脱氢酶催化产生的NADPH是还原型谷胱甘肽的重要辅酶,其在清除因老化胁迫而产生的活性氧中发挥重要作用,因此我们推测Zm ICDH1可能通过影响异柠檬酸脱氢酶的活性在种子抗老化中发挥重要作用。综上所述,本文利用玉米zmmyb59突变体发现该转录因子正调控种子抗老化能力,进一步发现Zm MYB59可以直接结合在Zm ICDH1的启动子区域正调控其表达。本研究结果为解析玉米种子抗老化能力的分子机制奠定了基础,同时为培育抗老化能力强的玉米新品种提供关键基因。