背景:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种恶性造血干/祖细胞疾病,其最主要特征是髓系原始幼稚细胞出现分化异常。长期以来,如何治疗复发难治性AML始终困扰着临床工作者。本课题组前期曾证明血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO1)在AML中过表达,但是关于HO1的详尽功能作用仍不清楚。目的:本课题旨在探索HO1表达与AML免疫微环境间的关系,并阐明HO1过表达通过抑制CD48诱导AML对NK细胞发生免疫逃逸的详细分子机制。方法:1.获取临床样本:依据《中国成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白selleckchem 3-Methyladenine血病)诊疗指南(2021年版)》及《中国复发难治性急性髓系白血病诊疗指南(2021年版)》中所列标准,在给予治疗前即收集初诊和复发AML患者的新鲜骨髓血,密度梯度离心法提取临床样本单个核细胞,将其培养于原代白血病细胞专用培养基中。2.分析HO1表达与AML免疫微环境中NK细胞水平的关系:通过肿瘤免疫评估资源(Tumor Immune Estimation Resource,TIMER)数据库评估HO1表达与AML免疫微环境之间的关系;正常组织和AML之间HO1的差异表达通过对癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)及基因型-组织表达(GenotypeTissue Expression project,GTEx)数据库的联合分析得来;接下来,收集HO1高/低表达显著差异的AML患者样本,采用流式细胞术评估这些患者中四种主要免疫细胞(CD4或CD8+T、B、NK细胞)的比例,以验证上述生物信息学数据库中的分析结果;为了深入阐明潜在机制,通过TCGA数据库分析HO1表达与AML中免疫检查点/配体的关系;随后通过流式细胞术验证TCGA数据库分析的结果。3.细胞株实验探索AML细胞中HO1究竟如何影响NK细胞:Real-time PCR和western blot检测HO1在白血病细胞株中的表达水平;过表达慢病毒(LV-HO1)转导细胞后,THP-1中的HO1表达得以上调,而HO1沉默慢病毒LV-HO1-RNAi(SiHO1)转导MV4-11细胞后,HO1表达下调。分别通过real-time PCR和western blot验证转导效率;生物发光成像系统检测调控HO1表达后AML细胞在NK细胞杀伤效应下的存活率;LDH释放实验检测调控HO1表达后AML细胞对共培养体系内NK细胞杀伤活性的影响;流式细胞术检测调控HO1表达后AML细胞对共培养体系内NK细胞脱颗粒(CD107a表达)和活化(CD69表达)的影响。4.选择6-8周的NOD/SCID IL-2Rγnull(NPG)雄性小鼠作为研究对象,小鼠被随机分为4组:EV1组、LV-HO1组、EV1+NK cells组、LV-HO1+NK cells组;将稳定转导HO1慢病毒的THP-1细胞皮下注射至相应分组小鼠背部,一旦肿瘤可见或可触及,则通过尾静脉输注NK细胞,每隔3天一次,共计进行9次治疗;将小鼠放置在活体成像系统的平台上进行观察;每隔3天测定一次肿瘤直径和重量;记录小鼠的生存时间。5.分析AML细胞中HO1下调CD48表达的机制:Western blot检测HO1过表达后AML细胞中乙酰化水平的变化;Real-time PCR和western blot检测HO1高/低表达AML患者中HDAC4/HDAC8/Sirt1的表达水平;流式细胞术分析SRT1720(Sirt1特异性激活剂)处理THP-1细胞后表面CD48的表达情况;流式细胞术分析selisistat(Sirt1特异性抑制剂)处理MV4-11细胞后表面CD48的表达情况;Realtime PCR、western blot和流式细胞术检测转导THP-1和MV4-11细胞中Sirt1和CD48的表达情况;免疫共沉淀实验评估AML细胞中HO1与Sirt1之间相互作用的情况。结果:1.本研究发现HO1与免疫评分、基质评分以及综合评分之间显著正相关,相关系数均大于0.6。HO1在AML中的表达明显高于正常组织。接下来,在AML患者中通过流式细胞术验证上述发现。我们的结果显示,HO1高表达组NK细胞比例显著低于HO1低表达组。进一步研究发现HO1表达与AML中的CTLA4、CD48、CD200R1(CD200R)、HAVCR2(CD366)、PDCD1LG2(CD273)、TNFRSF8(CD30)、VSIR(VISTA)、CD40、CD86和TNFRSF9(CD137)显著相关。然后在AML患者中通过流式细胞术验证TCGA分析的结果。我们的结果表明,HO1高表达组肿瘤细胞上CD48表面抗原表达显著低于HO1低表达组。2.一方面,在NK细胞的杀伤效应下,AML细胞中过表达HO1可提高肿瘤细胞的存活率,沉默HO1则增加AML细胞对NK细胞杀伤效应的敏感性。另一方面,在共培养体系内,AML细胞中过表达HO1可抑制NK细胞的杀伤活性,沉默HO1则增加NK细胞对AML细胞的杀伤活性。此外,LV-HO1组与EV1组相比,体系中NK细胞的CD107a和CD69表达明显降低。但是CD48的加入在一定程度上确认细节恢复了NK细胞的细胞毒活性,从而显著提高了LV-HO1组NK细胞的脱颗粒和活化。与此相反,Si-HO1组与EV2组相比,体系中NK细胞的CD107a和CD69表达明显提高。不过阻断2B4受体可在一定程度上削弱NK细胞的细胞毒活性,进而显著降低了Si-HO1组NK细胞的脱颗粒和活化。3.在AML小鼠模型中,LV-HO1组与EV1组相比,肿瘤增殖明显增加。此外,与EV1组相比,HO1过表达有效地促进了肿瘤体积、肿瘤重量和细胞增殖水平的增加。值得注意的是,予以NK细胞治疗后,LV-HO1组及EV1组小鼠肿瘤负荷均明显降低。对这4组进行生存分析表明,EV1+NK cells组小鼠的生存期最长,而其他3组小鼠的生存时间相似且均较短。4.HO1过表达显著降低了THP-1细胞内的泛乙酰化水平。进一步的研究发现,在AML患者中,HO1高表达组Sirt1蛋白水平显著高于HO1低表达组。接下来,在AML细胞中进行了一系列实验验证上述发现。结果表明,SRT1720明显下调了CD48在THP-1中的表达,而selisistat在MV4-11中显著上调了CD48的表达。在THP-1细胞中,LV-HO1组与EV1组相比,HO1过表达明显增加了Sirt1蛋白水平并下调了CD48的m RNA和蛋白水平。不过selisistat的加入通过对Sirt1的抑制一定程度上削弱了HO1对CD48的负调控,从而在LV-HO1组细胞中部access to oncological services分挽救了CD48的表达。在MV4-11细胞中,Si-HO1组与EV2组相比,HO1沉默明显降低了Sirt1蛋白水平并上调了CD48的m RNA和蛋白水平。但是通过对Sirt1的激活一定程度上恢复了HO1对CD48的负调控,SRT1720的加入降低了Si-HO1组细胞中CD48的表达。机制上,HO1可以在THP-1和MV4-11细胞中与内源性Sirt1结合形成复合物。结论:1.HO1表达与AML免疫微环境密切相关,靶向HO1可能是一种潜在的AML免疫治疗选择。AML患者中,HO1高表达组NK细胞比例显著低于HO1低表达组。HO1高表达组AML患者肿瘤细胞上CD48表面抗原表达显著低于HO1低表达组。2.在体外细胞株研究方面:AML细胞中HO1的过表达可通过靶向CD48-2B4轴抑制NK细胞的细胞毒性,从而诱导AML细胞对NK细胞发生免疫逃逸。在动物体内研究方面:HO1过表达促进了AML细胞在体内的生长,并抑制了AML小鼠中NK细胞的细胞毒性,从而诱导AML细胞在体内对NK细胞发生免疫逃逸。3.机制上,HO1在AML细胞中可与Sirt1相互作用,增加Sirt1的蛋白表达,使组蛋白乙酰化水平降低,从而抑制CD48的转录和表达,最终诱导AML细胞对NK细胞发生免疫逃逸。