萜类化合物种类繁多、结构骨架多样,以异戊二烯结构单元为基本骨架广泛存在于自然界中,根据骨架数目的不同,分为单萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜、多聚萜等;其中倍半萜作为数量最庞大、分布最广泛的萜类天然产物,由三个异戊二烯结构骨架组成,具有重要的生理活性及广阔的市场应用前景,广泛应用于食品、药品、化妆品等领域。不同倍半萜合酶催化共同前体底物法尼基焦磷酸分子(Farnesyl pyrophosphate,FPP)可以产生三百多种结构骨架不同的倍半萜产物。因此,倍半萜合酶独特的催化机理被认为是形成倍半萜结构和骨架多样性的基础,其催化活性不仅可以通过反应动力学来描述SAHA MW,还可以通过反应产物的数量和结构多样性来定义。倍半萜合酶结构与功能的关系一直是一个重要的研究方向,已知蛋白质晶体结构的解析为深入探究倍半萜合酶的催化机理提供了基础;然而,目前尚未发现酶活性口袋中特定氨基酸残基的规律性和特征性,这是探索倍半萜合酶催化机制和进化特点的关键。柏木脑合酶(epi-cedrol synthase,ECS1)是青蒿中被鉴定的第一个倍半萜合酶基因,其蛋白质序列与其他倍半萜合酶的蛋白质序列具有较高的同源性;ECS1催化FPP生成的主产物柏木脑(epi-cedrol)和副产物柏木烯(α-cedrene、β-cedrene)在医药、高能燃料等领域具有潜在的应用价值。目前对于ECS1活性口袋中影响酶催化功能的氨基酸残基的认识并不清晰,为了进一步明确倍半萜合酶催化机理和产物特异性之间的关系,本论文以ECS1作为探究对象,开展了以下工作:(1)ECS1的表达优化及功能鉴定。首先对ECS1进行生物信息学分析,分析结果表明ECS1不存在跨膜结构域,属于Ⅰ类萜烯合酶;其次构建原核表达载体并成功表达ECS1,通过在表达载体的N端加入SUMO促溶标签,将上清中目的蛋白的可溶性提高了26.083%;进一步优化蛋白表达条件,确定了重组蛋白表达的最佳诱导温度为16°C,最佳诱导剂浓度为0.01 m M。分别对ECS1的体外反应及体内代谢产物进行鉴定,确定了ECS1催化FPP生成主产物柏木脑和两种副产物α-柏木烯、β-柏木烯;酿酒酵母发酵120 h后,主产物柏木脑的产量为5.685 mg/L,副产物α-柏木烯和β-柏木烯的产量分别为3.741 mg/L和0.714 mg/L。(2)ECS1活性口袋氨基酸残基的确定及分析。运用基于模板的同源建模法使用swiss-model对ECS1进行同源建模,利用分子对接软件Auto Dock Vina将ECS1与底物分子FPP进行对接,理性分析获得了合理的ECS1-FPP分子对接构象,并且将距离底物分子5?范围内的氨基酸残基定义为ECS1的酶活性口袋,确定以下25个氨基酸残基F15、R262、W271、F292、Q295、T296、D299、D300、D303、I400、G401、Y402、C439、R440、D443、S447、E451、R454、H456、F512、S515、V516、Y520、D524、F526构成ECS1的活性口袋;同时采用丙氨酸扫描实验对酶活性口袋中的残基进行验证,基于分子对接构象的分析及体外酶促反应产物的检测,初步确定活性口袋中R262、D299、D300、D303、D443、S447、E451、R454、H456、F292、I400、R440、G401、W271、C439是影响ECS1催化功能的关键残基。(3)基于PSSM矩阵分析对活性口袋中的C439、R262、W271位点进行定点突变探究。利用PSSM矩阵评估ECS1活性口袋中的氨基酸残基在进化过程中突变成其他残基的频率,进一步明确了ECS1的进Compound 3抑制剂化特点及催tissue microbiome化过程中发挥重要作用的氨基酸残基。选择C439位点进行饱和突变,表明C439残基的极性影响ECS1酶活,筛选得到比酶活提高了28.481%的突变体C439S。定点突变R262位点,发现其对维持ECS1酶催化功能有重要作用,不仅能够与FPP的焦磷酸基团形成氢键作用,有助于碳正离子的形成,并且维持酶活性口袋的构象,破坏R262位点的功能会导致催化产物特异性发生变化,主产物转变为法尼醇。芳香族氨基酸残基作为倍半萜环化酶研究中的热点残基,对W271位点进行定点突变,使产物特异性发生变化,产生了新的倍半萜化合物法尼醇、法尼烯和姜黄烯,扩展了ECS1体外酶催化的产物谱,表明其侧链的苯环不仅参与ECS1活性口袋构象的维持,并且影响中间体2碳正离子的稳定性,保证了ECS1的催化功能。这些位点的突变探究进一步明确了ECS1的催化机制,为其他倍半萜环化酶催化机理的探究提供了重要的参考。