第一部分Tim-3在乳腺癌细胞中的作用及机制研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,也是女性癌症相关死亡的主要原因。免疫检查点的失调通过诱导T细胞衰竭在肿瘤免疫逃避中起重要作用。T细胞免疫球蛋白及粘蛋白结构域分子 3(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3,Tim-3),也被称为甲型肝炎病毒细胞受体 2(Hepatitis A Virus Cellular Receptor 2,HAVCR2),属于 Tim基因家族。Tim-3是一个I型跨膜蛋白,包括一个细胞外结构域,一个跨膜结构域和一个C末端细胞质尾巴。Tim-3有四个配体,包括半乳糖凝集素-9(Galectin 9,Gal-9)、癌胚抗原细胞粘附分子 1(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1,CEACAM-1)、高迁移率族蛋白 B1(High Mobility Group Box 1,HMGB1)和磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)。Tim-3作为负性免疫检查点,可表达在T细胞、DC细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞和肥大细胞等多种免疫细胞上。临床前研究显示,Tim-3抑制剂取得了与PD-1(Programmed death 1)抑制剂相似的疗效。另外,在肺癌体内模型中,PD-1抗体能够引起Tim-3表达的增加,提示Tim-3可能作为PD-1抑制剂耐药的分子标志物,因此,Tim-3有望成为有前景的治疗靶点。Tim-3能诱导免疫耐受,与肿瘤、哮喘、食物过敏、自身免疫疾病和慢性病毒感染的发病均相关。Tim-3能够通过诱导T细胞耗竭而发挥抑制肿瘤免疫的作用。Tim3+CD8+T 细胞能够下调 STAT5(Signal transducer and activator of transcription 5)和 P38 信号通路,阻断Tim-3通路能够增强抗肿瘤免疫并增强T细胞IFN-r的释放,抗Tim-3抗体能够诱导外周NK细胞IFN-r的释放。研究发现,Tim-3不仅表达在免疫细胞上,还表达在多种类型的肿瘤细胞上。肿瘤细胞中Tim-3的表达与非小细胞肺癌更晚的临床分期、胃癌的淋巴血管浸润、肾透明细胞癌的肺转移和结肠癌的淋巴转移相关。体外研究发现,Tim-3通过Akt/GSK-3/Snail信号通路诱导上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT),促进食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的转移。Tim-3 敲除显著抑制了 ESCC细胞株的增殖、迁移和侵袭。此外,干扰Tim-3表达可通过NF-κB/snail信号通路和EMT显著抑制骨肉瘤细胞的增殖和转移。荟萃分Antidiabetic medications析显示,实体瘤中Tim-3的高表达显著缩短了总生存率。但也有相反的结果报道,如下调Tim-3可促进结直肠癌细胞的侵袭和转移,而前列腺癌组织中Tim-3的低表达与转移性前列腺癌患者不良预后相关。不同的肿瘤类型和不同的Tim-3表达定位可能导致不同的预后结果。Tim-3在不同癌症中的预后意义仍存在争议,有待进一步研究。小样本研究显示Tim-3在乳腺癌细胞中也过度表达,并且与不良的预后相关。然而,Tim-3在乳腺癌发生、发展和侵袭转移中的确切机制尚未阐明。此外,Tim-3在肾细胞癌细胞系中对抗血管生成药物(Sunitinib)和mTOR抑制剂(Rapamycin)具有抵抗力,在淋巴瘤的ATN1细胞中能够诱导对阿霉素和卡铂的耐药,提示它可能在肿瘤血管生成和化疗耐药中发挥作用。因此,本研究中首先分析了 Tim-3在乳腺癌中的表达情况及其对预后的影响,然后探讨了其对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制,并评估了其在血管形成和细胞紧密连接中的作用。方法1.分析TCGA-BRCA数据库中Tim-3在乳腺癌和正常组织中的基因表达水平及与临床病理因素的相关性。2.分析KM-plotter乳腺癌数据库,探索Tim-3与乳腺癌局部复发和远处转移的相关性,探索Tim-3在不同分子分型乳腺癌中的作用及意义。3.通过慢病毒转染构建过表达Tim-3的三阴性乳腺癌系MDA-MB-231和Luminal型乳腺癌细胞系MCF7。体外实验探索Tim-3对乳腺癌细胞增殖、粘附、侵袭、迁移和肿瘤相关血管生成的影响及机制。采用细胞电阻抗传感技术(Electric Cell-substrate Impedance Sensing,ECIS)监测细胞的初始贴壁和连接、跨上皮电阻测定(Transepithelial Resistance,TER)和细胞通透性(Paracellular permeability,PCP)实验探索Tim-3在细胞紧密连接中的功能及机制。结果1.TCGA数据库汇总分析显示,与正常组织相比,Tim-3基因在乳腺癌组织中的表达水平显著升高(P<0.001)。不同乳腺癌分子亚型之间、不同临床分期和不同腋窝淋巴结分期的乳腺癌病人之间Tim-3的表达水平无统计学差异。2.分析KM-plotter乳腺癌数据库显示,总体人群中Tim-3高表达的患者无复发生存率(Relapse-free survival,RFS)明显下降(P=0.004),总生存率(Overall survival,OS)也有相似的趋势,但差异无统计学意义(P=0.099),提示总体人群中高表达Tim-3与乳腺癌不良的预后相关。高表达Tim-3在Luminal A(P<0.001)和Luminal B(P=0.039)亚型中与较差的RFS相关。而在基底样乳腺癌中,高表达Tim-3与较好的RFS相关(P<0.001)。对于OS,高表达Tim-3与luminalA亚型较差的预后相关(P=0.019),而在基底亚型中,高表达Tim-3的患者预后较好(P<0.001),提示Tim-3在乳腺癌不同分子亚型中作用机制可能不同。3.过表达Tim-3的乳腺癌细胞促进细胞的增殖、迁移、侵袭和肿瘤相关血管生成。机制上,Tim-3通过激活NF-κB/STAT3信号通路和调控下游基因表达[细胞周期蛋白D1(Cyclin D1,CCND1)、C-Myc、基质金属蛋白酶-1(Matrix Metallopeptidase 1,MMP1)、TWIST和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth facto,VEGF)上调,伴随着E钙粘蛋白下调]而发挥作用。此外,Tim-3下调紧密连接相关分子封闭带(ZO)-2、ZO-1和封闭蛋白(Occludin)而降低细胞间的紧密连接,这进一步促进肿瘤进展。结论1.生信分析结果显示,乳腺癌组织中Tim-3基因表达水平显著高于正常组织。在总人群中高表达Tim-3的乳腺癌患者与较差的无复发生存率相关。2.过表达Tim-3促进乳腺癌细胞的殖增、迁移、侵袭和肿瘤相关血管生成,同时降低细胞之间的紧密连接。机制上,Tim-3通过激活NF-κB/STAT3信号通路和调控下游基因表达[CCND1、C-Myc、MMP1、TWIST和VEGF上调,同时伴有E钙粘蛋白下调]而发挥其功能。Tim-3通过下调紧密连接相关分子ZO-2,ZO-1和Occludin,进一步促进肿瘤进展。第二部分Tim-3在血管内皮细胞中的作用及机制研究背景T细胞免疫球蛋白和粘蛋白家族分子与过敏、自身免疫和癌症等多种疾病相关,因此引起了越来越多的关注。Tim-3是一个重要的负性免疫检查点,在调节免疫细胞活性中起着关键作用,被认为是有前景的癌症免疫治疗靶点。Tim-3在内皮细胞上也有表达,在黑色素瘤、淋巴瘤、立克次体感染和动脉粥样硬化中发挥作用。表达Tim-3的黑色素瘤内皮细胞通过促进细胞内渗和外渗来增加肿瘤细胞的转移潜能。淋巴瘤衍生内皮细胞中Tim-3的表达通过与循环T细胞相互作用抑制CD4+T细胞的激活而促进淋巴瘤的生长和传播。临床上,B细胞淋巴瘤内皮Tim-3的表达水平与播散和不良预后相关。此外,Tim-3被证明是动脉粥样硬化的负调节分子。Tim-3通过c-Jun N末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase,JNK)途径保护人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)免受牛低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)诱导的细胞凋亡,并逆转对迁移的抑制作用。总之,Tim-3在人类内皮相关疾病中发挥重要作用。肿瘤远处转移是癌症死亡的主要原因之一,肿瘤细胞与其微环境之间的相互作用对肿瘤进展和转移至关重要,肿瘤血管生成是肿瘤进展的必要条件。最近的研究关注了从血管内皮细胞释放并促进肿瘤进展的“血管分泌因子”的重要作用。在内渗期间,肿瘤细胞物理接触内皮细胞并通过近分泌和旁分泌信号与其相互作用,进而刺激肿瘤细胞转移。因此,血管内皮细胞在肿瘤进展和转移中扮演重要角色。前期研究表明,作为Tim-3的家族成员,过表达Tim-1(HAVCR 1)能够通过调控ZO-1和ZO-2而降低人血管内皮细胞中紧密连接的形成。因此,在本部分研究中,我们在人肺微血管内皮细胞(Human microvascular endothelial cells,HMVECs)和 HUVEC 中研究了 Tim-3对血管内皮细胞增殖、迁移、侵袭和血管形成的影响,并随后分析了 Tim-3在血管内皮细胞紧密连接中的作用及机制。通过将肿瘤细胞与血管内皮细胞共培养,探索高表达Tim-3的肿瘤细胞对血管内皮细胞的影响。方法1.采用RT-qPCR检测HMVEC和HUVEC中Tim-3的表达情况,免疫组化评估乳腺癌组织切片中血管内皮细胞Tim-3蛋白的表达。2.用人Tim-3过表达(Tim-3 OE)质粒或空白对照载体[Scramble(Scr)]慢病毒转染HMVEC和HUVEC细胞,构建过表达Tim-3的血管内皮细胞系,采用Crizotinib浓度RT-qPCR和Western blot检测两种细胞系中Tim-3的表达水平。3.通过细胞增殖实验、细胞-基质粘附实验、基质胶侵袭实验、细胞划痕和血管生成实验探索过表达Tim-3前后HMVEC和HUVEC细胞增殖、粘附、迁移、侵袭和血管生成功能的变化及机制。4.采用ECIS监测内皮细胞的初始贴壁和连接、TER和PCP实验探索过表达Tim-3前后细胞紧密连接功能的变化。5.将过表达Tim-3的MDA-MB-231细胞和对照细胞分别加入Transwell小室的下室,将HUVEC细胞分别加入小室的上室进行共培养,检测血管内皮细胞单层上下TER的差异。结果1.HUVEC和HMVEC细胞中均有Tim-3表达,但表达水平较低。Tim-3在乳腺癌组织血管内皮细胞中表达较高,提示Tim-3参与乳腺癌微血管形成。2.通过慢病毒转染,成功构建过表达Tim-3的血管内皮细胞系。转染Tim-3质粒后,RT-qPCR和Western blot检测证实了Tim-3在基因和蛋白水平均显著增加。3.Tim-3通过激活CCND1、Ras同源基因家族成员A(Rho A)和VEGF受体2(VEGFR2)促进血管内皮细胞增殖、迁移、侵袭和血管形成。4.Tim-3通过降低ZO 2、Occludin和Claudin 1(CLND1)的表达而降低内皮细胞的紧密连接和跨上皮阻力。5.高表达Tim-3的乳腺癌细胞与血管内皮细胞共培养,能够降低单内皮细胞层的TER。结论1.血管内皮细胞系和乳腺癌组织血管内皮细胞中均有Tim-3的表达。2.Tim-3通过激活CCND1和RhoA促进血管内皮细胞增殖、粘附、迁移和侵袭。3.Tim-3通过促进VEGFR2蛋白的表达而促进血管形成。4.Tim-3通过降低ZO-2、Occludin和CLDN1表达而降低细胞间的紧密连接和跨上皮阻力。5.高表达Tim-3的乳腺癌细胞与血管内皮细胞共培养,能够降低单内皮细胞层的TER,提示血管内皮细胞之间的连接更松散,有利于肿瘤细胞侵入血管而发生转移。第三部分 Tim-3在乳腺癌化疗耐药中的作用及机制研究背景化疗被广泛应用于提高乳腺癌患者的生存,尽管乳腺癌患者的预后逐步改善,仍有许多患者会出现原发或继发耐药性,导致肿瘤复发和转移。目前,耐药是乳腺癌患者预后不良和生存率降低的主要原因。为了更好地治疗这些患者,克服耐药一直是一个巨大挑战。在乳腺癌治疗中已经发现了多种与耐药相关的机制,包括药物靶标内的体细胞突变或表观遗传变化、癌细胞异质性、癌症干细胞、癌症相关巨噬细胞和免疫细胞调节及代谢重编程等。越来越多的证据表明,靶向免疫检查点抑制剂如PD-1/PD-L1和CTLA-4在治疗癌症方面的光明前景。同时,这些分子在癌细胞的化疗耐药中也具有重要作用。免疫检查点分子以药物和细胞依赖的方式影响癌症的化疗耐药性。高PD-L1表达是乳腺癌局部复发和远处转移的不良预测因素,同时也是乳腺癌化疗耐药的重要预测因子。B7家族检查点也会导致乳腺癌细胞对化疗产生耐药,而靶向这些免疫检查点分子被认为是克服耐药的有效方法。近来研究显示,抑制或阻断Tim-3可以增强乳腺癌确认细节的化疗效果,因此对乳腺癌具有治疗价值。肿瘤内CD103+DCs高表达Tim-3,而Tim-3抗体促进这些DC表达CXCL9[Chemokine(C-X-C motif)ligand 9],从而增强CD8+T细胞功能而提高紫杉醇的治疗效果。Tim-3还能促进淋巴瘤ATN-1细胞对阿霉素和卡铂的耐药。在头颈部鳞状细胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)中,放疗和化疗后HNSCC中Tim-3的表达显著高于原发性HNSCC,提示Tim-3参与HNSCC的放疗和化疗耐药。Tim-3在乳腺癌中对化疗药物反应的作用及机制尚不完全清楚,因此本研究还探索了 Tim-3在乳腺癌化疗耐药中的作用及机制。方法1.选择22例接受新辅助化疗和手术的乳腺癌患者。患者均接受AC×4(表柔比星和环磷酰胺)序贯T×4(紫杉醇或多西他赛)方案进行新辅助化疗。免疫组化检测新辅助化疗前后乳腺肿瘤组织中Tim-3的表达水平及变化。2.构建过表达Tim-3的MDA-MB-231和MCF7细胞,检测细胞对紫杉醇和顺铂化疗药物的敏感性,采用Western blot和qPCR探索其作用机制。结果1.新辅助化疗前、后Tim-3在不同分子亚型乳腺癌组织中均有表达,但表达水平无统计学差异。与新辅助化疗前相比,化疗后肿瘤组织中Tim-3的表达水平明显升高,提示Tim-3可能参与乳腺癌细胞的化疗耐药。2.紫杉醇药物敏感实验在浓度为 10 nmol/L、20 nmol/L 和 40 nmol/L 紫杉醇时,MDA-MB-231 Tim-3 OE 细胞对紫杉醇的耐受性均高于对照的Scr细胞。与Scr细胞相比,MCF7 Tim-3 OE细胞在2.5 nmol/L和5 nmol/L浓度下对紫杉醇的耐受性也更强。在用单剂量紫杉醇(MDA-MB-231为10 nmol/L,MCF7为5 nmol/L)处理MDA-MB-231和MCF7细胞6小时和24小时后,Western blot结果显示,与对照细胞相比,Tim-3 OE细胞培养6小时后总NF-κB蛋白水平显著增加,Tim-3 OE细胞培24小时后p-NF-κB在两种细胞系中显著升高。紫杉醇处理24小时后,Tim-3 OE细胞中STAT3的蛋白水平显著高于MDA-MB-231和MCF7的Scr细胞。与Scr对照相比,6小时后CCND1在MCF7 Tim-3 OE细胞中上调。当加入NF-κB抑制剂SC75741或STAT3抑制剂Stattic进行药敏实验时,Tim-3诱导的紫杉醇耐药被消除,进一步证实了 NF-κB和STAT3参与Tim-3介导的紫杉醇耐药。3.顺铂药物敏感实验在加入浓度为8 μmol/L和16μmol/L顺铂时,MDA-MB-231 Tim-3 OE细胞对顺铂的耐受性高于Scr细胞。与Scr相比,MCF7 Tim-3 OE细胞在8 μmol/L、16μmol/L和32μmol/L浓度下对顺铂的耐受性也更强。结论1.与新辅助化疗前相比,化疗后肿瘤组织中Tim-3的表达水平明显升高,提示Tim-3可能参与乳腺癌细胞的化疗耐药。2.Tim-3增加了乳腺癌细胞对紫杉醇和顺铂的耐药性,对紫杉醇的耐药是通过激活NF-κB/STAT3信号通路和改变CCND1的表达来实现的。