目的:阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)是一种常见的睡眠呼吸障碍。OSA首选的治疗方案是无创正压通气,但是依从性问题可能限制了治疗效果。寻找有效的药物治疗该病的靶点对该病的治疗至关重要。OSA的特点是在睡眠期间反复发作上气道塌陷,这表明与睡眠相关的上气道扩张肌的肌张力降低在OSA发病机制中的关键作用。作为上气道肌肉中最大且研究最广泛的颏舌肌对于上气道的稳定至关重要。通过对颏舌肌的调控的研究找到合适的药物或靶点是目前研究药物治疗该病的有效方法。细胞内钙离子([Ca2+]i)浓度变化是普遍存在的信号机制,常伴随着膜电位的变化,参与神经细胞兴奋性的调控。舌下运动神经元(HMs)直接调控颏舌肌活动,受多种神经调节剂和离子通道的影响,许多调节机制均可通过调控HMs中的钙离子增加颏舌肌活动,比如组胺、5-HT。2-氨基乙酯二苯基硼酸(2-APB)是生理研究中常用的medullary raphe一种[Ca2+]i调节剂,其调控钙离子机制多种多样。有证据表明,其可以通过[Ca2+]i升高引起细胞兴奋性增高。2-APB通过舌下神经核(HMN)调控颏舌肌的作用和机制尚不清楚。本研究的目的是希望通过体内核团给药和体外膜片钳实验的方法探讨2-APB通过HMN对颏舌肌调控的作用及其相关的离子通道和信号转导机制,进一步完善OSA的中枢调控机制,同时发现相关的药物治疗靶点,为OSA的药物治疗提供理论基础。方法:(1)不同浓度2-APB通过HMN对颏舌肌调控的作用:使用异氟烷将大鼠麻醉后,通过脑立体定位技术在延髓一侧HMN给予留置套管,同时植入电极记录颏舌肌、膈肌、颈部肌肉肌电,使用张力换能器记录大鼠呼吸频率。大鼠术后恢复半小时,各项指标稳定时给予注射人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)300nl并记录半个小时上述指标作为基线对照,随后在同一注射位点依次给予不同浓度(5m M、10m M、20m M,300nl/次)的2-APB,每个浓度记录半个小时,待颏舌肌肌电恢复到基线后继续注射下一个浓度。对比不同浓度的2-APB对颏舌肌肌电(包括紧张性和呼吸相关性)、膈肌肌电、呼吸频率、颈部肌肉肌电的作用。(2)麻醉状态下HMN给予不同类型离子通道阻断剂后观察2-APB对颏舌肌的影响分别将钠钙交换体(NCX)抑制剂benzamil(5m M)、氯化镍(20m M),细胞内钙离子调节剂环匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)(5m M)、BAPTAAM(1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N’N’-tetraacetic acid)(0.2m M)、钌红(5m M),非选择性阳离子通道阻断剂氯化镧(20m M)、L型钙离子通道(Ltype calcium channel,LTCC)阻断剂维拉帕米(10m M)、地尔硫卓(10m M),钠离子通道阻断剂普鲁卡因(20m M)预先或同时与2-APB(10m M)注射到大鼠HMN中,研究应用阻断剂后观察2-APB对颏舌肌的影响。(3)膜片钳进一步验证2-APB对HMs的兴奋作用将8周左右大鼠延髓HMN制成急性脑片,采用膜片钳技术中的电流钳技术,分别记录和分析1m M 2-APB对HMs AP发放速率和膜电位的影响。随后观察无钙ACSF以及预先给予0.5m M CPA孵育30分钟后2-APB对HMs AP发放速率和膜电位的影响。结果:(1)不同浓度2-APB对大鼠颏舌肌的作用HMN中给予注射不同浓度(5m M,10m M,20m M,300nl/次)的2-APB后可以引起颏舌肌肌电活动增强,颏舌肌肌电活动增强呈现浓度依赖性,并且浓度越高持续时间越长。其中10m M和20m M与ACSF相比颏舌肌肌电差异有统计学意义。紧张性相关颏舌肌肌电活动增加更明显,持续时间更长,在浓度为20m M时紧张性颏舌肌肌电活动增加了824.07%,而呼吸相关性颏舌肌活动增加了140.06%。但对呼吸频率、膈肌肌电、颈部肌肉肌电无影响。(2)2-APB通过HMN调控颏舌肌的相关离子通道1)NCX抑制剂benzamil、氯化镍均可抵消2-APB对颏舌肌的兴奋效应,其中benzamil与ACSF对比可明显降低颏舌肌肌电,两者差异有统计学意义。2)预先给予细胞内钙离子调节剂CPA、BAPTA-AM、钌红均可阻断2-APB对颏舌肌的兴奋效应,其中钌红除了抑制2-APB的兴奋作用外,相对于ACSF基线进一步降低了颏舌肌肌电活动,两者差异有统计学意义。3)预先给予LTCC阻断剂维拉帕米和地尔硫卓,而不是非选择性阳离子通道阻断剂氯化镧可Pexidartinib以阻断2-APB对颏舌肌的兴奋效应,其中维拉帕米降低颏舌肌肌电更明显,与基线对比两者有统计学差异。4)普鲁卡因不能完全阻断2-APB引起的颏舌肌肌电升高,与ACSF相比差异有统计学意义。(3)2-APB在体外对HMs的兴奋作用在体外膜片钳实验中,1m M的2-APB可以引起HMs AP的发放速率和膜电位升高,与ACSF对比,差异有统计学意义。无钙ACSF对2-APB引起的HMs AP发放速率和膜电位升高无明显影响,两者对比有统计学意义。预先给予CPA孵育后可以阻断2-APB引起的HMs AP发放速率和膜电位升高,与2-APB给药前相比差异无统计学意义。结论:(1)2-APB可以通过作用于舌下神经核浓度依赖性增加颏舌肌活动水平,其中紧张性相关颏舌肌肌电升高更明显,持续时间更长。(2)2-APB引起颏MLN8237采购舌肌活动增加与HMs细胞内钙离子浓度升高有关,其可能通过促进质网钙存储的释放,继而激活NCX,引起细胞去极化。LTCC参与了2-APB调控颏舌肌的过程。