【研究背景】难治性癫痫持续状态(Refractory status epilepticus,RSE)为神经科棘手的危急重症,由癫痫持续状态(Status epilepticus,SE)进展而来,其癫痫发作持续进行且无法被临床常用的苯二氮卓类药物有效终止。RSE时持续的癫痫发作不仅导致高达35%的死亡率,而且造成大脑神经元的显著死亡,在RSE幸存患者中遗留严重的神经功能缺损,仅21%的RSE幸存患者的神经功能可恢复到发病前水平。然而目前临床尚缺乏针对RSE切实有效的神经保护策略,其原因在于介导RSE后神经元死亡的核心分子尚不明确,从而缺乏新的有效的神经保护疗法。神经元的存活依赖于充足的能量供给,而RSE给大脑能量供给带来严重负担。线粒体氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,OXPHOS)功能紊乱、ATP耗竭和能量衰竭是造成RSE后神经元死亡的核心机制之一。因此,明确在RSE中调控神经元能量稳态的关键分子,对理解RSE造成神经元死亡的机制、寻找新的神经保护靶点具有重要意义。降钙素原氨基端肽(Aminoprocalcitonin,NPCT)是从其前体肽降钙素原(Procalcitonin,PCT)氨基末端裂解而成的产物,其氨基酸序列在脊椎动物间高度保守。尽管前体肽PCT是目前临床常用的感染血清标志物,NPCT的生物学功能迄今仍不是十分清楚,相关研究几乎空白,既往只有零星报道提示其可能在中枢神经系统发挥作用。我们前期通过实验发现,海马NPCT的表达在RSE时显著升高,且NPCT对神经元的OXPHOS具有调控作用,因此我们猜想:海马NPCT可能通过调控神经元的OXPHOS参与了RSE后神经元损伤与死亡过程。深入研究NPCT对神经元的生物学功能,明确NPCT在RSE后神经元死亡中的作用,对理解RSE导致神经元损伤的机制、开发新的神经保护疗法具有重要意义。【研究目的】1.探索NPCT在大脑中的宏观及微观分布特征,绘制大脑NPCT的表达谱。2.建立地西泮耐药的RSE动物模型,阐明海马NPCT在RSE的时空表达特点。3.解析NPCT的生理功能,明确NPCT对神经元的直接生物学效应及机制。4.建立离体无镁细胞癫痫模型,从细胞水平研究NPCT的神经保护作用和机制。5.在RSE动物模型中,从动物水平阐述海马NPCT的神经保护作用及机制。【研究方法】1.利用免疫组织化学染色研究NPCT在Sprague-Dawley(SD)大鼠大脑各个代表性脑区及核团的宏观分布情况,利用免疫组化评分对表达丰度进行定量并绘制NPCT的表达谱;利用免疫荧光染色、免疫电镜等观察NPCT在大鼠海马的微观表达特征;利用免疫吸附实验等验证染色抗体的特异性。2.建立锂-匹罗卡品SE模型,从行为学、脑电(Electroencephalogram,EEG)、生存率等方面研究不同发作持续时间对地西泮耐药性的影响,从而建立地西泮耐药的RSE动物模型;利用实时定量PCR(q PCR)、westBYL719配制ern blot、免疫荧光染色、免疫电镜等研究海马NPCT在地西泮耐药的RSE动物模型中的时空表达特征。3.离体原代培养大鼠海马神经元并给予NPCT肽刺激,利用绿色荧光蛋白质粒转染、免疫荧光染色、western blot、Sholl分析等方法研究NPCT对神经元的神经营养作用;利用高通量RNA测序、Seahorse XFe细胞代谢分析、线粒体功能检测等方法研究NPCT对神经元OXPHOS的调控作用。4.建立离体无镁细胞癫痫模型,利用PI/Hoechest双染法、相差成像法、JC-1探针等观察神经元死亡情况及线粒体膜电位;利用q PCR、western blot等检测NPCT在模型中的转录翻译情况;制备靶向干预NPCT的中和抗体,在无镁细胞癫痫模型中利用中和抗体拮抗NPCT、或外源性补充NPCT,观察对造模后神经元死亡和线粒体功能的影响。5.在地西泮耐药的RSE动物模型中,通过外周给药和侧脑室给药两种方式给予NPCT中和抗体,利用视频-EEG监测观察干预NPCT对RSE发作和地西泮耐药性的影响;通过Fluoro-Jade C染色、免疫荧光等观察干预NPCT对海马神经元死亡和胶质细胞激活的作用;利用线粒体功能检测等阐明干预NPCT对RSE后海马能量衰竭和线粒体功能障碍的影响。【研究结果】1.NPCT在大脑中的宏观与微观分布(1)NPCT在大脑灰质中分布极其广泛,定量分析表明NPCT在下丘脑、丘脑、海马、嗅觉相关脑区等灰质中表达尤为高,而在白质纤维中几乎不表达;NPCT在SE发作激活的脑区中也有广泛分布。(2)在海马,NPCT主要表达于神经元和部分星形胶质细胞,小胶质细胞不表达NPCT;NPCT在海马神经元突触前结构与突触后结构中均存在。2.海马NPCT在地西泮耐药的RSE动物模型中的时空表达特征(1)随着发作时间延长,动物对地西泮的行为学与EEG耐药性增加,生存率下降。(2)海马NPCT在RSE动物模型中转录和翻译增加,NPCT特异性地过表达于海马CA3锥体神经元,且NPCT表达的增加与地西泮耐药性同步出现。(3)RSE时海马NPCT在突触部位发生重新分布,突触后含有NPCT的突触显著减少,不含有NPCT的突触显著增多。3.NPCT对海马神经元的神经营养作用和线粒体OXPHOS的调控(1)NPCT可同时增加NR1、NR2B、GABRG2亚基的表达,增加兴奋性突触和抑制性突触的密度,但不改变兴奋性与抑制性的平衡。(2)NPCT可促进神经元树突生长,增加树突分支复杂性,并促进树突棘形成。(3)NPCT对神经元转录组的影响主要富集于OXPHOS和线粒体氧化呼吸链复合体,NPCPLX3397溶解度T可增强神经元线粒体氧化呼吸链复合体I、IV、V的功能活性、提高神经元细胞内ATP含量。(4)NPCT可提高神经元的最大呼吸能力和呼吸储备能力,并直接下调凋亡效应分子Caspase-3的表达,从而增强神经元对环境压力的抗性。4.NPCT在离体无镁细胞癫痫模型中的神经保护作用(1)无镁细胞癫痫模型导致的线粒体功能障碍发生在神经元死亡之前。(2)无镁细胞癫痫模型造模后,编码NPCT的Calca基因转录显著增加,且其可变剪接向产生更多NPCT的方向显著偏移,NPCT蛋白表达上调、分泌增多。(3)中和抗体拮抗NPCT显著增加了造模后OIT oral immunotherapy神经元的死亡;外源性补充NPCT肽虽不能逆转神经元死亡的过程,但对线粒体功能仍有一定保护作用。5.NPCT在地西泮耐药的RSE动物模型中的神经保护作用及其对癫痫发作的影响(1)外周给予NPCT中和抗体显著增加了RSE模型动物14天死亡率,加重了海马神经元的死亡,但对星形胶质细胞和小胶质细胞的激活无明显影响。(2)中枢给予NPCT中和抗体降低了RSE发作时的EEG功率谱总功率,并导致EEG在地西泮给药后迅速衰竭,动物死亡率增加。(3)中枢给予NPCT中和抗体特异性地加重了CA3锥体神经元的死亡,而对星形胶质细胞和小胶质细胞的激活无明显影响。(4)在RSE动物模型中枢给予NPCT中和抗体干扰了RSE后线粒体氧化呼吸链复合体I、IV、V功能的代偿性反应,加重了RSE后海马ATP的耗竭。【研究结论】本研究首次揭示了NPCT在大脑内极其广泛的分布和NPCT在海马神经元突触前后的表达。我们建立了地西泮耐药的RSE动物模型并发现海马NPCT在RSE发作过程中反应性升高。我们通过多种手段揭示了NPCT可能是一种新型的神经营养因子,并作为一种神经肽可直接调控神经元线粒体氧化呼吸链复合体的活性、增加神经元ATP供给、提高神经元的最大呼吸能力和呼吸储备能力。在离体无镁细胞癫痫模型和地西泮耐药的RSE动物模型中,NPCT可能通过调控神经元OXPHOS发挥神经保护作用。本研究为理解RSE后神经元死亡的机制提供了新思路,为RSE神经保护提供了新靶点。