龙眼(Dimocarpuslongan Lour.)属于无患子科龙眼属,是热带亚热带常绿果树,也是重要的经济作物之一。龙眼胚胎发育的状态直接影响龙眼果实的产量及品质。由于龙眼早期合子胚取样困难,限制了龙眼胚胎分子水平的研究。龙眼体胚发生系统的高同步性、高频性以及再生能力强等特点,为研究龙眼胚胎发育提供了良好的替代材料。木葡聚糖内转移葡糖基化酶/水解酶(xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase,XTH)是一种细胞壁修饰蛋白,影响细胞扩张和细胞壁松弛,参与植物生长发育过程。研究表明,植物体胚发生(Somaticembryogenesis,SE)过程伴随着细胞壁生理生化的改变。XTH如何通过修饰细胞壁进而参与龙眼体胚发生早购买PCI-32765期机制还有待研究。因此,本研究对龙眼XTH基因家族进行全基因组鉴定,并对其在体胚发生早期以及龙眼胚性愈伤组织(embryogenic callus,EC)不同处理下的表达模式分析。同时,筛选出DlXTH23.5/25,进行转录因子(transcriptionfactor,TF)调控网络构建及验证,进一步探究其参与龙眼体胚发生早期细胞壁的修饰的作用机制。主要研究结果如下:1.龙眼XTH基因家族的全基因组鉴定及其在体胚发生早期的表达分析基于龙眼‘HHZ’三代基因组对龙眼XTH家族成员进行全基因组鉴定。龙眼XTH家族共有25个成员,存在2对物种内共线性基因以及1 1对(拟南芥)和5对(水稻)物种间共线性基因。启动子顺式作用元件结果显示,DlXTH家族成员含有大量应激反应元件和胁迫响应元件。大部分DlXTH家族成员在体胚发生早期的EC(8个)与球形胚(Globularembryos,GE)(8个)阶段高表达,推测其有利于维持细胞胚性状态以及促进体胚发生。16个检测到表达的DlXTH基因中有13个在35℃高温胁迫下上调,说明DlXTH家族成员响应高温胁迫调控。结合 RNA-seq、ATAC-seq 和 ChIP-seq(H3K4me1 修饰)结果发现,SE早期过程大多数差异表达的DlXTH基因染色质可及性变化与高水平的H3K4me1修饰相关。基于龙眼体胚发生早期转录组数据库,筛选出差异表达基因DlXTH23.5/25。qRT-PCR结果显示,DlXTH23.5/25在龙眼体胚发生早期的GE阶段显著上调,说明其转录水平的累积可能有利于促进龙眼体胚发生。通过龙眼体胚发生早期XET活性测定表明,XET活性在胚性紧实结构阶段积累并在GE阶段下调,推测XET含量的动态变化可能影响龙眼体胚发生早期进程2.XTH23.5/25亚细胞定位及龙眼胚性愈伤组织瞬时表达研究基于上述研究,对DlXTH23.5/25进行不同物种间系统进化树构建、蛋白序列比对以及二级结构和三级结构预测,结果表明DlXTH23.5/25高度保守,且可能定位在细胞膜相关结构并含有信号肽。通过过表达DlXTH23.5/25瞬时转化烟草,验证了 DlXTH23.5/25蛋白定位于细胞膜。此外,在细胞质中出现点状荧光信号,推测其位于内质网中新分泌的木葡聚糖上,并催化木葡聚糖的转运和转糖基化。同时,瞬时过表达DlXTH23.5/25转化龙眼EC表明,DlXTH23.5/25能促进XET的积累,提示DlXTH23.5/25可能通过调控XET活性参与龙眼体胚发生早期过程。3.WRKY31、ERF1/5与XTH23.5/25调控网络验证及其在高温胁迫下的龙眼体胚发生早期阶段表达调控研究为进一步验证DlXTH家族调控网络,对DlXTH23.5/25相关TFs进行预测,并结合龙眼体胚发生早期阶段转录组数据库筛选出转录因子DlWRKY31和DlERFl/5。qRT-PCR结果显示,TFs在GE阶段表达量最高,与DlXTH23.5/25在龙眼体胚发生早期的表达趋势一致,推测转录因子DlWRKY31、DlERFl/5正调控DlXTH23.5/25的表达。烟草活体荧光成像和双荧光素酶报告基因试验结果显示,转录因子DlWRKY31、DlERF1/5可以激活DlXTH23.5/25的表达,推测TFs通过结合DlXTH23.5/25启动子区域并激活其转录。通过过表达TFs瞬时转化转化龙眼EC和原生质体进一步验证了转录因子DlWRKY31、DlERF1/5 促进DlXTH23.5/25 的表达。龙眼EC在不同温度处理下的转录组数据表明,转录因子DlWRKY31、DlERF1/5以及DlXTH23.5/25均能响应高温DS-3201配制胁迫(35℃)。qRT-PCR结果进一步显示,DlXTH23.5/25在高温胁迫下的表达量显著上调且XET活性升高。同时,过表达转录因子DlWRKY31、DlERF1/5以及DlXTH23.5/25均能促进烟草中XET含量的积累,说明TFs和DlXTH23.5/25组成的调控网络可能通过调控XET的活性参与热胁迫下龙眼的调控通路。4.龙眼 XTH23.5/25的功能研究为进一步探究XTH23.5/25在龙眼中的功能,通过过表达DlXTH23.5转化龙眼EC,获得稳转细胞系,并对该细胞系进行体胚分化,探索DlXTH23.5在龙Buffy Coat Concentrate眼体胚发生早期的作用。结果表明,过表达DlXTH23.5能够促进龙眼体胚发生早期进程。为进一步验证DlXTH23.5/25在龙眼生长发育过程中是否参与细胞壁修饰,利用发根农杆菌介导的遗传转化体系,发现过表达DlXTH23.5/25能促进龙眼毛状根的生长和XET含量的积累。石蜡切片和甲苯胺蓝染色结果显示,DlXTH23.5/25转基因龙眼毛状根细胞壁加厚,说明DlXTH23.5/25可能通过促进XET的活性进而调控细胞壁加厚。qRT-PCR结果显示,DlXTH23.5/25在高温胁迫处理6 d的龙眼根系中表达量显著上调,且过表达DlXTH23.5/25龙眼毛状根XET活性升高,ROS含量降低。结合ROS清除剂相关基因的表达模式,推测DlXTH23.5/25可能通过调控ROS清除剂的含量来降低自身活性氧含量,从而减少高温胁迫所造成的损伤。综上所述,从龙眼基因组中鉴定25个DlXTH基因,并筛选龙眼体胚发生早期差异表达基因DlXTH23.5/25。DlXTH23.5/25通过调控XET含量,使细胞壁加厚,从而参与龙眼生长发育过程。在高温胁迫(35℃)下,DlXTH23.5/25可能通过增加XET含量,参与细胞壁加厚过程,进而响应高温胁迫。DlXTH23.5/25也能通过降低自身活性氧含量,从而降低高温胁迫所造成的损伤。此外,转录因子DlWRKY31、DlERF1/5与DlXTH23.5/25的启动子区域结合并激活其转录,在高温胁迫下,TFs和DlXTH23.5/25组成的调控网络可能通过调控XET的活性参与热胁迫下龙眼体胚发生早期过程。