鸭坦布苏病毒(Duck temubusu virus,DTMUV)于2010年在我国首次爆发流行,主要引起蛋鸭卵巢出血、产蛋量急剧下降,严重危害了养鸭业的健康发展。鸭坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属,是迄今发现的第一个感染水禽的黄病毒,深入研究DTMUV与宿主之间的相互作用,不仅能为揭示DTMUV感染宿主的免疫机制和致病机理提供数据,还具有一定的公共卫生意义。本研究首先搭建了用于研究鸭源天然免疫的IFN-β双荧光素酶报告系统,以实验室分离的DTMUV流行毒株为研究对象,用转录组学测序方法分析了DTMUV感染原代鸭胚成纤维细胞(DEFs)的差异表达基因,筛选出一系列DTMUV诱导宿主天然免疫反应的相关宿主分子,解析了鸭源DEAD box RNA解旋酶47(du DDX47)和解旋酶3(du DDX3)的分子结构、表达特征及其生物学功能,并重点探讨了du DDX47促进DTMUV增殖的作用机制。具体研究内容如下:1.鸭源IFN-β启动子及其IRF1、NF-κB结合位点双荧光素酶报告系统的构建为了解DTMUV感染与宿主天然免疫应答之间的关系,根据已报道的鸭β干扰素启动子序列设计特异性引物,通过RT-PCR从鸭脾脏c DNA中克隆得到鸭源干扰素β(du IFN-β)基因的启动子片段,分别构建了3个荧光素酶报告载体:du IFN-β启动子核心区域的报告质粒pdu IFN-β-Luc、4个IRF1结合位点重复序列的报告质粒4×IRF1-Luc和4个NF-κB结合位点重复序列的报告质粒4×NF-κB-Luc。将构建的报告载体分别转染传代DEFs,poly(I:C)刺激24 h后检测其荧光素酶活性,结果表明3个双荧光素酶报告载体构建成功。2.DTMUV感染DEFs转录组学对DTMUV感染24 h的原代DEFs和未感染病毒的细胞进行了转录组学测序,相关数据已上传至NCBI-SRA数据库,登录号SUB7261213。测序结果表明,与对照组相比,病毒感染24 h有1838个差异表达基因,其中649个呈下调表达,1189个呈上调表达。对组学测序筛选到的1838个差异表达基因进行GO功能分类和KEGG信号通路富集,结果表明DTMUV感染后DEFs差异表达的基因与天然免疫信号通路有关,主要包括了激活IFN-β信号通路的模式识别受体信号通路(RIG-I、NOD样和Toll样)、与炎症反应相关的NF-κB信号通路(NF-kappa B signaling pathway)、与病毒入侵相关的C型凝集素受体信号通路(C-type lectin receptors signaling pathway)等。为了检验转录组学测序结果,通过荧光定量RTPCR对筛选到的差异表达基因IFN-a、IFN-β、viperin、Mx1、IRF1、IFIT5和OASL进行验证,获得了与转录组学一致的结果,说明转录组学数据可信。根据转录组学测序结果,选取上调显著的DDX47和DDX3进行了深入研究。3.鸭源DDX47(du DDX47)促进DTMUV增殖的机制研究根据NCBI Genbank预测的du DDX47基因序确认细节列设计引物,以鸭脾脏c DNA为模板扩增获得其全长c DNA。序列分析表明,du DDX47基因全长1389 bp,编码463个氨基酸,相关序列信息已上传至NCBI Gen Bank,登录号OQ626368。结构预测表明du DDX47的N端172-675为保守的DEAD结构域,C端859-1104为保守的HELICc结构域。通过荧光定量RT-PCR检测证实du DDX47在鸭的多个组织中广泛表达,并以胰脏和脾脏中的表达丰度最高,亚细胞定位分析显示du DDX47主要表达于细胞核。通过q RT-PCR和IFA检测证实超表达du DDX47显著促进DTMUV的复制。q RT-PCR和Western Blot分析DTMUV感染对内源du DDX47表达的影响,发现在原代DEFs中,DTMUV剂量依赖性地上调内源DDX47的转录水平和蛋白水平的表达。为了分析DTMUV编码蛋白与du DDX47的相互作用,构建了DTMUV 10个编码蛋白的真核表达质粒,通过共转染和免疫共沉淀(Co-IP)对其相互作用进行检测,更多证实du DDX47与DTMUV编码的3个结构蛋白(Caspid、Pr M、Envelope)和4个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS4A、NS4B)存在相互作用;考虑到du DDX47是RNA解旋酶,有可能通过RNA与病毒编码蛋白相互作用,因此于细胞裂解液中加入核糖核酸酶A(RNase A)处理后再进行Co-IP,结果显示du DDX47与Caspid、Pr M、NS1、NS4A、NS4B仍存在相互作用,反向Co-IP获得了一致的结果,说明du DDX47与DTMUV Caspid、Pr M、NS1、NS4A及NS4B的相互作用不依赖RNA,是一种直接的相互作用。进一步通过间接免疫荧光和激光共聚焦分析也证实了du DDX47与DTMUV编码的7种蛋白的相互作用,Western Blot检测发现du DDX47显著上调Caspid和NS4A的表达,且呈剂量依赖性,而Caspid、NS4A不仅与DTMUV的免疫逃逸相关,还与病毒粒子的装配及黄病毒复制诱导的内质网重构密切相关,推测du DDX47在DTMUV的复制过程中发挥重要的作用。已证实多种DDX通过抑制IFN-β的表达促进病毒的增殖,因此检测了du DDX47对IFN-β表达的影响。利用双荧光素酶报告系统检测发现,du DDX47显著抑制Poly(I:C)诱导的IFN-β启动子激活,且呈剂量依赖性,利用si RNA干扰内源性DDX47表达后显著增强poly(I:C)诱导的IFN-β启动子激活。进一步检测了du DDX47对IFN-β信号通路中的关键转录因子IRF1和NF-κB表达的影响,结果发现du DDX47也显著抑制Poly(I:C)诱导的IRF1和NF-κB的转录活性。随后构建了du DDX47不同结构域的截短突变体,转染细胞后,通过双荧光素酶报告系统检测证实DEADc结构域是du DDX47抑制IFN-β产生的关键区psychiatry (drugs and medicines)域。4.鸭源DDX3(du DDX3)的克隆表达及其功能分析已有文献报道人源DDX3促进黄病毒科中西尼罗病毒(WNV)的复制,抑制登革热病毒(DENV)的复制,但鸭源DDX3(du DDX3)的功能尚无文献报道。根据预测的du DDX3基因序列设计全长引物,以鸭脾脏c DNA为模板扩增得到du DDX3全长c DNA。测序证实du DDX3基因全长1959 bp(Gen Bank登录号:MH360982);通过在线预测网站进行结构分析,发现du DDX3包含9个特征性motifs,N端存在DEAD结构域、C端存在HELICc结构域。Mega6.06构建不同物种DDX3的进化树表明,du DDX3基因与北京鸭、鸡、金丝雀等禽类处于同一小分支,遗传进化关系较近。组织表达谱分析结果表明du DDX3在鸭的多个组织中广泛表达,表达丰度较高的是脾脏和胰脏。亚细胞定位试验检测发现du DDX3在DEFs的胞浆和胞核中均有表达。在抗病毒试验中,对du DDX3的功能进行了初步分析,发现超表达du DDX3对DTMUV的复制有一定的影响,但与对照相比差异不显著。双荧光素酶报告试验证实超表达du DDX3能激活NF-κB和IRF1诱导IFN-β的产生,干扰掉内源du DDX3的表达能显著减弱poly(I:C)诱导IFN-β启动子激活。为了确定du DDX3诱导IFN-I产生的关键结构域,构建了表达4种du DDX3截短突变体的真核表达质粒,转染细胞后,通过双荧光素酶报告系统检测证实,缺乏HELICc结构域及HELICc加C末端结构域的突变体du DDX3(165-400)和du DDX3(1-400)均不能激活IFN-β启动子,说明HELICc是du DDX3诱导IFN-β产生的关键结构域。