坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus),有包膜、不分节段的单股正链RNA病毒,通过蚊媒传播,主要感染鸭,雏鸭、产蛋鸭易感,育成鸭有一定的抵抗力,还可感染鸡、鹅等,主要引起蛋禽产蛋下降,给养禽业带来较大的经济损失。本研究根据课题组从临床鸭病料中分离获得并提交至NCBI的鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)CQW1株(登录号:KM233707.1)基因序列及Gen Bank上金黄色葡萄球菌核酸酶(Staphylococcus aureus nuclease,SNase,登录号:CP006630.1)序列,设计编码DTMUV衣壳蛋白(Capsid,Cap)和SNase基因的特异性引物,分别对Cap和SNase进行扩增、融合、构建融合重组质粒、融合蛋白稳定细胞系并开展体内外抗DTMUV的研究,结果报道如下:1.DTMUV Cap与SNase融合蛋白生物学特性分析为探究SNase的抗病毒效果,将DTMUV Cap与SNase进行融合,获得目的片段Cap-SNase和Cap-Linker-SNase,并构建真核重组质粒pcDNA3.1(+)-Cap-SNase和pcDNA3.1(+)-Cap-LinSCH772984临床试验ker-SNase,于BHK21和DEF细胞中进行表达与定位检测,通过DNA降解和MTT法分别检测融合蛋白的酶活性和细胞毒性,并于BHK21和DEF细胞中进行抗DTMUV试验。结果显示:融合蛋白Cap-SNase和Cap-Linker-SNase主要于细胞质中表达,热处理的蛋白经DNA降解试验发现,随着蛋白量递增,Cap-SNase和Cap-Linker-SNase均表现出越明显的降解DNA作用,相同蛋白量,Cap-Linker-SNase降解DNA的效果优于Cap-SNase;表达融合蛋白Cap-SNase和CMDV3100说明书ap-Linker-SNase的BHK21和DEF细胞形态、死亡情况与阴性对照组无差异,MTT法检测发现表达Cap-SNase和Cap-Linker-SNase的BHK21和DEF细胞活性较阴性对照组细胞活性无差异。抗病毒结果显示,在病毒感染48 h、60 h、72 h、84 h,BHK21和DEF细胞Cap-SNase和Cap-Linker-SNase组产生子代病毒的载量较阴性对照组均有不同程度下降。以上结果表bioinspired design明,融合蛋白Cap-SNase和Cap-Linker-SNase具耐热性和核酸酶活性但无细胞毒性,且表现出抗DTMUV的作用。2.DTMUV Cap与SNase融合蛋白稳定细胞系构建、特性分析及体外抗DTMUV效果探究为持续性探究融合蛋白抗DTMUV效果,利用慢病毒构建单克隆细胞系,从基因和蛋白水平检测其稳定性,用DNA降解法检测细胞系表达的融合蛋白Cap-SNase和Cap-Linker-SNase的酶活性,并对单克隆稳定细胞系开展抗DTMUV试验。结果显示,阳性单克隆细胞系即使传至80代,仍能检出目的基因和目的蛋白;DNA降解试验发现,随着蛋白量递增(2.5μg、3.0μg、3.5μg),融合蛋白降解DNA现象越明显;稳定细胞系的细胞形态和状态与BHK21细胞无差异,抗病毒试验发现,BHK21/Cap-Linker-SNase组在36 h、48 h、60 h病毒载量较对照组下降约10~(0.5)倍,而Cap-SNase组抗病毒效果不明显。以上结果说明,构建的单克隆细胞系BHK21/Cap-SNase和BHK21/Cap-Linker-SNase能稳定遗传和表达,且表达的融合蛋白Cap-SNase、Cap-Linker-SNase均具有耐热性和核酸酶活性,整合至BHK21的融合蛋白为细胞耐受,无细胞毒性,但细胞系表达的融合蛋白无明显的抗DTMUV效果。3.以慢病毒为载体的融合蛋白体内抗DTMUV探究为进一步探究融合蛋白Cap-SNase和Cap-Linker-SNase在鸭体内抗DTMUV的效果,以慢病毒为载体,将携带融合蛋白的慢病毒浓缩后感染7日龄鸭胚,将鸭胚孵化成雏鸭,再用DTMUV感染7日龄雏鸭13 d后收集鸭粪便,采集血液、内脏组织(心、肝、脾、肺、肾、脑),通过病理观察、RT-q PCR、体重监测等试验检测融合蛋白于鸭体内抗DTMUV的效果。病理切片观察结果显示,融合蛋白Cap-SNase和Cap-Linker-SNase能缓解DTMUV感染导致鸭心、肝、脾、肺、肾、脑组织出血等病理症状;RT-q PCR结果显示,融合蛋白组鸭血液、组织(脑、脾)中病毒载量和粪便排毒量显著低于1640和lentivirus-PHBLV组的病毒载量和粪便排毒量;体重监测结果显示,DTMUV感染导致鸭生长迟缓,而融合蛋白能缓解该现象。以上结果表明,融合蛋白Cap-SNase和Cap-Linker-SNase在鸭体内具有抗DTMUV的效果。综上,本研究通过将DTMUV Cap与SNase进行融合,开展体内外抗DTMUV的研究,体外瞬时表达的融合蛋白表现出抗DTMUV效果,稳定细胞系表达的融合蛋白无明显的抗DTMUV效果,以慢病毒为载体的融合蛋白于鸭体内表现出抗DTMUV效果。