免疫共刺激分子CD80、CD86为Ⅰ类跨膜糖蛋白,同属于免疫球蛋白超家族成员,通常表达于巨噬细胞(MΦ)、树突状细胞(DC)以及活化的B细胞flexible intramedullary nail上。在T细胞通过TCR-多肽-MHC发生活化时,CD80、CD86形成异源二聚体,与T细胞上的CD28或CTLA-4受体相结合,提供T细胞selleck活化或抑制的第二个共刺激信号;该信号轴在启动、维持和调节T细胞活化、增殖或抑制等方面具有至关重要的作用。目前人和鼠CD80、CD86已得到深入研究,利用抗人或鼠CD80、CD86抗体能够深入研究抗原提呈细胞(如MΦ、DC等)的表型和功能以及T细胞激活机制。然而,到目前为止,关于禽类特别是鸡CD80、CD86(chCD80、chCD86)的研究还十分匮乏。由于缺乏功能性的抗chCD80、chCD86抗体,至今不能定义和研究鸡抗原递呈细胞的表型和功能。为此,本研究通过原核表达制备了重组chCD86胞外区蛋白;通过杂交瘤技术制备了能够识Canagliflozin核磁别天然chCD86的单克隆抗体,并用于流式细胞术检测表达chCD86的细胞。同时,我们表达了 chCD80原核和真核蛋白,通过真核质粒脾脏免疫制备了能识别真核及天然chCD80的多抗血清。为定义和深入研究鸡巨噬细胞、树突状细胞的表型与功能奠定了基础。具体研究内容如下:1.chCD86克隆、表达与纯化根据GenBank中收录的chCD86基因序列,设定特异性引物,提取鸡脾脏单个核细胞总RNA,通过RT-PCR分别扩增了 chCD86全长,chCD86胞外区序列(ed-chCD86)。通过系统发育树分析发现,鸡CD86哺乳动物亲缘关系较远,氨基酸水平同源性均不足30%。将chCD86胞外区序列和全长基因分别构建到原核表达载体pET-28a(+)和真核表达载体pCAGGS上,经测序鉴定获得重组载体pET28a-ed-chCD86和pCAGGS-chCD86。将原核重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导、SDS-PAGE及Western blotting鉴定,成功表达重组chCD86胞外区融合蛋白(His-chCD86),目的蛋白以包涵体形成表达,大小为28kDa,其表达量可达19.5mg/L菌液。将pCAGGS-chCD86转染DF-1细胞,经过间接免疫荧光(IFA)鉴定,chCD86真核蛋白获得表达,其大小为65 kDa,提示其可能存在糖基化修饰。2.抗chCD86单克隆抗体的制备与鉴定使用纯化的His-chCD86胞外区重组蛋白免疫小鼠,通过杂交瘤技术筛选获得了 9株稳定分泌抗chCD86的单抗,分别命名为1C2、1D3、2G10、3C3、3D4、3F6、4A2、4B2、5A1。通过 Ig 亚类鉴定,1D3、3C3、3F6、4B2、5A1 重链为 IgG1,2G10 为IgG2a型,1C2、3D4、4A2为IgG2b型,抗体轻链均为κ链;间接ELISA测定腹水效价大于1:409600。通过IFA、Western-Blotting鉴定发现,所有单抗均特异性识别原核和真核表达的chCD86蛋白;流式细胞术表面染色鉴定发现,3株单抗(1C2、1D3、3C3)能特异性地检测到鸡外周血单个核细胞(PBMC)中的chCD86阳性细胞群,检测频率约为1.4%。结果表明,所制备的抗chCD86单抗具有识别chCD86天然构象的能力,并能初步应用于流式表面染色。3.chCD80重组表达与多克隆抗体制备根据GenBank中收录的chCD80基因序列,设定特异性引物,通过RT-PCR扩增去信号肽的chCD80(sd-chCD80)和chCD80全长基因,并将chCD80去信号肽序列和全长基因分别构建到原核表达载体pET-28a(+)和真核表达载体pCAGGS上,经测序鉴定获得重组载体pET28a-sd-chCD80和pCAGGS-chCD80。将原核重组质粒pET28a-sd-chCD80转化Rosetta(DE3)中经IPTG诱导,重组的chCD80融合蛋白(His-chCD80)获得表达,大小为35kDa,其表达量可达6mg/L菌液。将pCAGGS-chCD80转染CHO细胞,经过间接免疫荧光(IFA)鉴定,重组chCD80获得真核表达。将此质粒通过小鼠脾脏免疫2次,制备了抗chCD80的鼠多抗。经IFA、WB验证,抗chCD80的鼠多抗能够识别真核表达和天然的chCD80蛋白。综上所述,本研究以重组chCD86胞外区蛋白作为免疫原,通过杂交瘤技术制备了可特异性识别天然chCD86的单抗并可初步应用于流式细胞术表面染色;利用chCD80真核质粒脾脏免疫,制备了 chCD80多抗血清。这些结果为研究鸡抗原递呈细胞功能奠定了基础。