鱼类的牙齿是鱼的摄食器官,具有重要的作用,鱼类牙齿可以阻止食物逃脱进行捕食,然后咬碎撕裂食物便于进食。鱼类的牙齿起源于皮肤齿,也称为楯鳞,主要分为颌齿和咽齿,颌齿在软骨鱼和硬骨鱼类中都广泛存在,但咽齿较为局限的出现于鲤科,雅罗鱼亚科等鱼类中。咽齿对鱼类摄食扮演着巨大的作用且具有极高的更新替换频率。目前关于鱼类牙齿的研究多集中在颌齿的发育调控上,对咽齿发育特异基因及其相应分子调控机制研究较为缺乏。本研究以青鳉和斑马鱼为研究对象,运用转录组测序(RNA-Seq)技术比较青鳉无咽齿(第三对)、有咽齿(第五对)鳃弓基因表达情况,并与斑马鱼无咽齿(第四对)、有咽齿(第五对)鳃弓转录组测序结果进行比对,筛选分析调控鱼类咽齿发育的候选基因。进一步运用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼咽齿发育关键基因纯合突变品系,通过茜素红染色、组织学分析等方法比较野生型及突变品系生长、咽齿发育及数量等情况,验证关键基因对鱼类咽齿发育的调控功能。主要研究结果如下:1.青鳉和斑马鱼咽齿发育特征及其关键调控基因的挖掘运用转录组测序(RNA-seq)技术,对3月龄青鳉无咽齿、有咽齿鳃弓和斑马鱼无咽齿、有咽齿鳃弓进行转录组测序。结果表明,青鳉有咽齿鳃弓与无咽齿鳃弓相比,共鉴定出1576个差异表达基因,其中有1144个差异表达基因上调,432个差异表达基因下调。差异表达基因分析结果表明scpp9、cts12、sp7、panx3、scpp5等基因在有咽齿鳃弓上高表达,在无咽齿鳃弓上表达量较低;而bmp5、bmp6、bmp10等bmp家族基因在无咽齿鳃弓上高表达,在有咽齿鳃弓上表达量较低。KEGG富集分析结果表明,在青鳉有咽齿鳃弓上调的差异表达基因主要富集在谷胱甘肽代谢通路、ECM-受体相互作用通路、氨基酸的生物合成通路、淀粉和蔗糖代谢通路、糖酵解和糖异生通路、钙离子通路等信号通路;在青鳉有咽齿鳃弓下调的差异表达基因主要富集在鞘脂类代谢通路、细胞因子及其受体相互作用通路、肠道免疫网络的Ig A生成通路、细胞粘附分子通路、细胞凋亡等信号通路。将青鳉无咽齿、有咽齿鳃弓转录组数据与斑马鱼无咽齿、有咽齿鳃弓转录组数据进行比对。结果表明,青鳉有咽齿鳃弓上调的差异表达基因和斑马鱼有咽齿鳃弓上调的差异表达基因共有187个基因,青鳉有咽齿鳃弓下调的差异表达基因与斑马鱼有咽齿鳃弓下调的差异表达基因共有21个基因。青鳉无咽齿、有咽齿鳃弓与斑马鱼无咽齿、有咽齿鳃弓有着相似的差异表达基因和KEGG富集通路,青鳉和斑马鱼在有咽齿鳃弓上调的差异表达基因富集到相同的9个信号通路,在有咽齿鳃弓下调的差异表达基因富集到相同的3个信号通路。从青鳉和斑马鱼差异表达基因中选取15个基因(odam、sp7、panx3、cts12、col1a1b、enRAD001使用方法tpd5b、spp1、scpp1、scpp5、scpp9、bmp2a、bmp5、bmp6、bmp10、bmp16)进行q RT-PCR,q RT-PCR结果与RNA-seq的结果一致。2.Bmp5和bmp6基因对斑马鱼咽齿发育的调控作用研究对2dpf、3dpf和5dpf斑马鱼bmp5、bmp6基因进行原位杂交分析,结果表明,bmp5、bmp6基因均在2dpf、3dpf和5dpf斑马鱼鳃弓部位强烈表达。使用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼bmp5、bmp6基因敲除突变品系,与野生型斑马鱼相比,bmp5突变体序列第二外显子出现2bp缺失,产生移码突变,导致蛋白质翻译在第172个氨基酸的位置提前终止;bmp6突变体序列第四外显子出现19bp缺失,产生移码突变,导致蛋白质翻译在第216个氨基酸的位置提前终止。对90dpf野生型斑马鱼和bmp5、bmp6突变体斑马鱼进行茜素红染色,染色结果表明,与野生型斑马鱼相比Transmission of infection,bmp5、bmp6突变体斑马鱼咽齿数量明显减少,与野生型斑马鱼的5-4-2和2-4-5排列不同,bmp5突变体的咽齿排列为4-3-1和1-3-4,缺失6颗咽齿,bmp6突变体的咽齿排列为4-2和2-4,缺失10颗咽齿。对野生型、bmp5和bmp6纯合子斑马鱼咽齿进行组织切片,结果表明bmp5和bmp6纯合子的咽齿骨细胞数量减少,且鳃耙中存在较多空洞,咽齿组织结构不致密。对野生型和bmp5突变体斑马鱼各个生长阶段(30dpf、60dpf、90dpf)的生长数据进行测量,结果表明,在30dpf时,bmp5突变体斑马鱼的体长和体重均高于野生型斑马鱼。但在60dpf和90dpf时,bmp5突变体斑马鱼的体长和体重均显著低于野生型斑马鱼。对10dpf和15dpf野生型和bmp5突变体斑马鱼进行茜素红染色,结果表明bmp5突变体咽齿和头部骨骼矿化较野生型快。将bmp5突变体和bmp6突变体斑马鱼繁殖交配筛选出bmp5和bmp6双纯合突变体,茜素红染色结果表明bmp5和bmp6双纯合突变体咽齿数量明显减少,咽齿排列为4-2和2-4,且bmp5和bmp6双纯合突变体鳃部肿大、肋骨畸形、鳍条短小、骨密度降低,在75dpf时逐渐死亡。3.Scpp9基因selleck对斑马鱼咽齿发育的调控作用研究对2dpf、3dpf和5dpf斑马鱼scpp9基因进行原位杂交分析,结果表明,在5dpf斑马鱼中scpp9基因仅在咽齿有表达,且表达信号较高。使用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼scpp9基因敲除突变品系。结果表明,与野生型斑马鱼相比,scpp9突变体序列第二外显子出现13bp缺失,产生移码突变,导致蛋白质翻译在第115个氨基酸的位置提前终止。我们对90dpf野生型斑马鱼和scpp9突变体斑马鱼进行茜素红染色,染色结果表明,与野生型斑马鱼相比,scpp9突变体斑马鱼咽齿数量明显减少,与野生型斑马鱼的5-4-2和2-4-5排列不同,scpp9突变体的咽齿排列为4-4-1和2-4-5,缺失2颗咽齿。对10dpf和15dpf野生型斑马鱼和scpp9突变体斑马鱼进行茜素红染色,结果表明,在10dpf时,scpp9突变体斑马鱼没有形成鳃耙,仅矿化了4颗咽齿。对野生型和scpp9纯合子斑马鱼咽齿进行组织切片,结果表明,相较于野生型斑马鱼,scpp9纯合子的咽齿骨细胞数量减少,且鳃耙中存在较多空洞,咽齿组织结构不致密。本研究通过对青鳉和斑马鱼有无咽齿鳃弓进行RNA-seq,筛选鉴定出了调控鱼类咽齿发生发育的关键基因如bmp5、bmp6和scpp9等;并使用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼bmp5、bmp6和scpp9纯合突变品系,研究了斑马鱼bmp5、bmp6、scpp9突变体和bmp5-bmp6双纯合突变体咽齿的数量形态和排列特征。本研究结果将为后续的鱼类咽齿发育提供理论依据,并为脊椎动物牙齿发育再生奠定基础。