朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)、二斑叶螨(Tetranychus urticae)和柑橘全爪螨(Panonychus citri)等叶螨,严重危害蔬菜、水PD-0332991抑制剂果等1000多种寄主植物,是重要的农业害螨。理想的害螨防治策略是建立“生物防治-化学防治”协同治理体系,即在害螨大爆发时有限使用选择性杀螨剂快速压低害螨种群数量,并在此基础上利用天敌捕食螨将害螨种群持续控制在经济阈值以下,既保护了天敌,又降低了农业损失,形成良性循环。因此,对害螨高效、对捕食螨等非靶标生物安全的选择性杀螨剂是实现害螨绿色防控的核心组成。基于对害螨个体活性而非分子靶标结构开发的现有多数杀螨剂选择性不高,在防治害螨的同时也杀死了捕食螨,打破了害螨-天敌复合体系的平衡,易导致害螨再猖獗。因此,阐明特定选择性杀螨剂在害螨和捕食螨间具有毒理学意义的分子靶点差异,进而靶向开发更多对害螨高效、对捕食螨安全的选择性杀螨剂是成功建立害螨“生物防治-化学防治”协同治理体系的关键。近年来在国内外登记使用的线粒体琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀螨剂(succinic dehydrogenase inhibitor,SDHIs)就是一类具有优异选择性的杀螨剂,它们对害螨高效,对天敌捕食螨等非靶标生物安全;然而这种选择性的分子机制尚未明确,这在很大程度上制约了这类选择性杀螨剂的持续开发。本研究以害螨朱砂叶螨、柑橘全爪螨及捕食螨巴氏新小绥螨(Neoseiulus barkeri)为研究对象,系统研究了非靶标因素(药剂穿透、代谢活化和解毒代谢)和靶标因素(靶标亲和力)与以丁氟螨酯/AB-1为代表的SDHIs杀螨剂优异选择性的关系,明确了作用靶标差异在丁氟螨酯/AB-1选择性中的重要地位,并通过生物化学、生物信息学、分medroxyprogesterone acetate子建模和CRISPR/Cas9基因编辑技术证明了害螨和捕食螨等非靶标生物SDH C亚基间关键氨基酸位点差异是丁氟螨酯/AB-1具优异选择性的重要原因,主要研究结果如下:1.丁氟螨酯对害螨和捕食螨的选择性使用SDHIs类杀螨剂丁氟螨酯、腈吡螨酯、pyflubumide和乙唑螨腈分别对朱砂叶螨(室内种群Tc-SS,云南种群Tc-YN)、柑橘全爪螨(重庆种群Pc-CQ)和巴氏新小绥螨(重庆、福建和北京种群:Nb-CQ、Nb-FJ和Nb-BJ)进行生物测定。丁氟螨酯对害螨Tc-SS、Tc-YN和Pc-CQ的LC_(50)分别为7.53 mg/L、2.52 mg/L和5.77 mg/L,而在丁氟螨酯最大溶解浓度下(100,000 mg/L),巴氏新小绥螨Nb-CQ、Nb-FJ和Nb-BJ的死亡率都低于5%,表明其对巴氏新小绥螨的LC_(50)大于100,000mg/L;丁氟螨酯对不同害螨和捕食螨种群的选择性均大于13,000倍。腈吡螨酯、pyflubumide和乙唑螨腈对朱砂叶螨Tc-SS的LC_(50)分别为4.22 mg/L、6.39 mg/L和3.74 mg/L,其在最大溶解浓度下(腈吡螨酯最大溶解浓度为50,000 mg/L、pyflubumide最大溶解浓度为100,000 mg/L、乙唑螨腈最大溶解浓度为50,000 mg/L)对不同巴氏新小绥螨种群的致死率仍远低于50%,腈吡螨酯、pyflubumide和乙唑螨腈对朱砂叶螨和巴氏新小绥螨的选择性均大于11,000倍。SDHIs类杀螨剂均表现出对害螨高效、对捕食螨安全的优异选择性特点。2.丁氟螨酯对不同螨的表皮穿透及其代谢差异丁氟螨酯进入螨体发挥作用,需经过表皮穿透、代谢活化和解毒代谢等过程。笔者用相同剂量的丁氟螨酯分别处理朱砂叶螨和巴氏新小绥螨3 h后,使用HPLC检测到朱砂叶螨和巴氏新小绥螨体内的丁氟螨酯含量分别为5.53±0.82μg/100 mg螨和5.74±1.06μg/100 mg螨,无显著差异。丁氟螨酯在朱砂叶螨和巴氏新小绥螨体内均可被水解为AB-1,其含量分别为0.12±0.06μg/100 mg螨和0.19±0.05μg/100 mg螨,无显著差异。因此,丁氟螨酯在害螨和捕食螨间的表皮穿透和代谢活化没有显著差异,也不是介导其优异选择性的主要原因。为了进一步探究解毒代谢能力是否介导丁氟螨酯的选择性,笔者分别使用与细胞色素P450酶(cytochrome P450 monooxygenases,P450s)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)和酯酶(carboxyl/cholinesterases,CCEs)对应的抑制剂增效醚(PBO)、顺丁烯二酸二乙酯(DEM)和脱叶磷(DEF)对朱砂叶螨和巴氏新小绥螨进行增效剂生物测定。在两种螨P450s、GSTs和CCEs酶活性被显著抑制的情况下,三种增效剂PBO、DEM和DEF对丁氟螨酯对害螨的毒力具有增效或拮抗作用,其增效比分比为1.42、2.25和0.51;三种增效剂对丁氟螨酯对巴氏新小绥螨的毒力没有明显的增效作用。以上研究结果表明,相对于朱砂叶螨,巴氏新小绥螨的解毒酶活性被抑制后,并不能增加其对丁氟螨酯的敏感性,说明解毒代谢能力不是丁氟螨酯对捕食螨安全的主要原因。3.丁氟螨酯/AB-1对害螨和捕食螨靶标的影响对靶标酶SDH活性检测结果表明,丁氟螨酯活性代谢物AB-1对朱砂叶螨、柑橘全爪螨和巴氏新小绥螨SDH的抑制中浓度(IC_(50))分别为1.79 n M、3.45 n M和682.26 n M,AB-1对巴氏新小绥螨SDH的IC_(50)分别是对朱砂叶螨和柑橘全爪螨的381倍和198倍。经丁氟螨酯处理后,朱砂叶螨体内ATP含量持续下降,至处理后3 h,相较于对照组下降了66%;使用丁氟螨酯处理巴氏新小绥螨后,其体内ATP的含量并无显著变化。此外,与ATP含量变化趋势一致,受丁氟螨酯胁迫后,朱砂叶螨呼吸能力表现出持续的下降趋势(处理后3 h内);巴氏新小绥螨的呼吸能力不受丁氟螨酯处理的影响,趋势平稳。以上结果表明丁氟螨酯/AB-1能显著抑制害螨SDH的活性,影响其生物学功能,而对巴氏新小绥螨SDH的活性以及生物学功能则无显著影响,暗示出害螨和捕食螨间作用靶标差异是丁氟螨酯/AB-1在二者之间产生选择性的主要原因。4.介导丁氟螨酯/AB-1选择性的靶标差异位点的鉴定生物信息学分析和分子建模结果表明:不同SDHIs类药剂与不同物种的靶标酶SDH均结合于醌(Q-site),且与醌具有相互作用的关键氨基酸残基高度保守;分子对接结果显示,AB-1与朱砂叶螨SDH模型的对接分数和结合自由能分别为-8.5和-58.19 kcal/mol,AB-1与巴氏新小绥螨SDH模型的对接分数和结合自由能分别为-7.4和-48.61 kcal/mol,说明AB-1与朱砂叶螨SDH的结合亲和力更强(对接分数和结合自由能越小,结合亲和力越强)。进一步分析预测到可能介导害螨和捕食螨靶标SDH与丁氟螨酯/AB-1产生结合亲和力差异的关键差异氨基酸基序。将关键氨基酸基序在两种螨之间进行互换突变模拟,发现AB-1对朱砂叶螨SDH的结合能力变弱(对接分数和结合自由能均升高,分别为-6.8和-56.49kcal/mol),对巴氏新小绥螨的SDH的结合亲和力变强(对接分数和结合自由能均降低,分别为-8.8和-52.93 kcal/mol)。多重序列比对发现预测的与丁氟螨酯/AB-1毒力差异相关的关键氨基酸基序在害螨中高度保守,以“Y-T”(酪氨酸-苏氨酸)为特征,在捕食螨等非靶标生物中也高度保守,以“H-X-X”(组氨酸-X-X)为特征。5.CRISPR/Cas9明确关键氨基酸位点差异介导丁氟螨酯/AB-1选择性的功能为了明确害螨和捕食螨等非靶标生物关键氨基酸位点差异与丁氟螨酯/AB-1选择性的关系,将包括捕食螨和果蝇等非靶标生物的特征氨基酸基序“H-X-X”突变为害螨特征氨基酸基序“Y-T”和“L-T”(亮氨酸-苏氨酸),构建果蝇突变品系。基于果蝇CRISPR/Cas9基因编辑,分别获得了HLT-YT品系和HLT-LT品系。生物测定结果显示,相较于野生型果蝇W1118品系,两个突变品系对SDHIs的敏感性显著增加(AB-1和腈吡螨酯未对W1118品系表现出毒力效果,而对HLT-YT品系果蝇的LD_(50)分别为1,619.94μg/g和6,760.68μg/g;AB-1对HLY-LT品系果蝇的LD_(50)为32,840.14μg/g),对作用于其它靶标杀螨剂的敏感性则无显著变化(谷氨酸氯离子通道激动剂阿维菌素对W1118品系、HLT-YT品系和HLT-LT品系的LD_(50)分别为110.74μg/g、84.54μg/g和64.40μg/g;线粒体复合物Ⅲ抑制剂联苯肼酯对W1118品系、HLT-YT品系和HLT-LT品系的LD_(50)均大于56,980μg/g);AB-1能显著抑制突变型果蝇HLT-YT品系和HLT-LT品系SDH的相关生物功能,但是对野生型果蝇SDH的相关生物功能无明显影响。相较于AB-1对野生型果蝇SDH的抑制(IC_(50)=2.79μM),AB-1对HLT-YT和HLT-LT果蝇SDH的抑制能力分别显著提高14获悉更多4倍和45倍(HLT-YT品系IC_(50)=19.42 n M,HLT-LT品系IC_(50)=62.26 n M)。因此,本研究证明了害螨和捕食螨SDH C亚基相对应特征氨基酸基序差异(害螨:Y-T;捕食螨:H-X-X)是丁氟螨酯/AB-1在二者之间具有优异选择性的重要原因。为进一步获得叶螨突变品系,探究关键氨基酸的功能,笔者尝试构建叶螨CRISPR/Cas9基因编辑技术体系,以期定点突变叶螨关键氨基酸获得相应叶螨基因突变品系。笔者成功敲除了朱砂叶螨体色相关八氢番茄红素脱氢酶Tc01g11270基因,突变型朱砂叶螨眼色和体色均发生了显著变化,表明建立起了朱砂叶螨基因编辑敲除技术体系;但遗憾的是未能在朱砂叶螨上实现同源重组的定点突变,未能将朱砂叶螨SDH C亚基上介导选择性的Y-T突变为H-X-X。