1.研究背景抑郁症(Major depressive disorder,MDD)在是一种常见的精神疾病,青少年抑郁症有复发率高,功能预后差等特点。因此,进一步探索青少年抑郁症的发病机制和治疗靶点具有重要的理论和现实意义。早期生活压力(应激)可引起表观遗传的改变,是构成抑郁症的主要发病机制之一。动物实验和临床研究均发现,抑郁症的发生与特定的DNA甲基化修饰密切相关。脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是存在于中枢神经系统的生长因子。BDNF对神经系统的发生发育、功能维持有重要作用,而其功能障碍则参与了抑郁症的发病过程。在人类和啮齿类动物中,BDNF启动子Ⅳ显著促进BDNF活性依赖性转录,且研究提示,BDNF启动子Ⅳ甲基化水平的变化与抑郁症的发生密切相关。DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)与DNA去甲基化相关酶共同维持正常的甲Smoothened Agonist分子式基化水平。DNMTs与BDNF启动子Ⅳ的甲基化及BDNF的表达密切相关。5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-AzaD)一种 DNMT 抑制剂,可直接抑制DNA甲基化,并可在多种抑郁样动物模型中诱导快速和持续的抗抑郁作用。BDNF启动子Ⅳ区的高甲基化可以影响BDNF的转录过程,进而影响BDNF的表达。青少年期的应激是否引起BDNF启动子Ⅳ甲基化发生短期和长期的变化,这一变化在青少年抑郁症发病机制中的作用如何尚不十分清楚。本研究采用慢性不可预知性温和BYL719说明书应激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)制作动物模型,探讨特定年龄阶段的慢性应激是否影响小鼠行为及BDNF启动子Ⅳ,DNMTs与DNA去甲基化相关酶的表达,以及是否对小鼠前额叶皮层(Prefrontal cortex,PFC)和海马(Hippocampus,HIP)中BDNF的表达及神经发育产生影响。同时,使用5-AzaD是否对上述改变具有调节作用,从而阐明BDNF启动子Ⅳ的甲基化在青少年抑郁障碍的发生中的作用,为抑郁症的早期治疗提供了理论依据。2.研究目的2.1.1考察CUMS对青少年期小鼠抑郁样行为、前额叶皮层和海马中BDNF启动子Ⅳ的甲基化、甲基Image guided biopsy转移酶和去甲基化相关酶、BDNF表达和海马神经发生的短期及长期影响。2.1.2探讨5-AzaD对经历CUMS的青少年小鼠在成年后的抑郁样行为、前额叶皮层和海马中BDNF启动子Ⅳ的甲基化、甲基转移酶和去甲基化相关酶、BDNF表达和神经发育的影响,以明确BDNF启动子Ⅳ的甲基化在抑郁症中的作用。3.材料与方法3.1 CUMS对青少年期小鼠行为、前额叶皮层和海马BDNF启动子Ⅳ甲基化和海马神经发生的短期和长期的影响。3.1.1实验动物与分组60只雄性C57小鼠(21日龄)分为四组:青少年对照组(AdoC)、青少年CUMS组(AdoS)、成年对照组(AduC)和成年CUMS组(AduS)。7天的适应性喂养后对照组小鼠不给予刺激,而应激组小鼠接受21天的慢性应激。造模后,青少年组小鼠进行行为测试,测试后的第二天处死;在70天时对成年小鼠进行行为测试,在行为测试之后的第二天被处死。3.1.2实验方法(1)连续三周的慢性不可预知性温和应激。(2)造模结束,依次进行行为学实验对青年和成年小鼠的抑郁样行为和空间学习记忆能力进行评估。(3)采用DNA甲基化分析检测青年和成年小鼠前额叶皮层和海马BDNF启动子Ⅳ的甲基化水平。(4)采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测青年和成年小鼠前额叶皮层和海马甲基转移酶和去甲基化相关酶表达量。(5)用免疫印迹法(Western blotting,WB)检测青年和成年小鼠前额叶皮层和海马BDNF表达水平。(6)采用免疫荧光检测青年和成年小鼠海马神经发生。3.2青少年期CUMS和5-AzaD对成年小鼠行为、前额叶皮层和海马BDNF启动子Ⅳ甲基化及神经发育的影响。3.2.1实验动物与分组雄性C57小鼠(21日龄)54只,分为三组即:对照组(C)、CUMS组(S)和CUMS+5-AzaD组(S+A)。一周的适应后,对照组小鼠不给予CUMS刺激,CUMS组小鼠经历21天的CUMS,CUMS+5-AzaD组小鼠经历21天刺激和5-AzaD治疗。3.2.2实验方法(1)采用与3.1.2相同的方法进行CUMS造模。(2)造模结束后,采用与3.1.2相同的方法进行行为学测试与评估。(3)采用DNA甲基化分析检测成年小鼠前额叶皮层和海马BDNF启动子Ⅳ的甲基化水平。(4)采用qPCR检测成年小鼠前额叶皮层和海马甲基转移酶和去甲基化相关酶表达水平。(5)采用WB检测成年小鼠前额叶皮层和海马BDNF表达水平。(6)采用免疫荧光和高尔基染色检测成年小鼠前额叶皮层和海马神经发育。4.实验结果4.1 CUMS对青少年期小鼠行为以及前额叶皮层和海马BDNF启动子Ⅳ甲基化和神经发育的短期和长期的影响。CUMS导致青年和成年小鼠的抑郁样行为和空间学习记忆能力损害,前额叶皮层和海马中BDNF启动子Ⅳ的甲基化和甲基转移酶表达增高,去甲基化相关的酶和BDNF表达减少以及海马神经发生障碍。4.2青少年期CUMS和5-AzaD对成年小鼠行为以及前额叶皮层和海马BDNF启动子Ⅳ甲基化和神经发育的影响。5-AzaD改善青少年期CUMS导致的成年小鼠的抑郁样行为和空间学习记忆能力的损害,降低前额叶皮层和海马中BDNF启动子Ⅳ的高甲基化水平和升高的甲基转移酶水平并且改善BDNF表达和神经发育障碍。5.结论5.1青少年期CUMS导致小鼠抑郁样行为以及前额叶皮层和海马中BDNF启动子Ⅳ的甲基化、甲基转移酶和去甲基化相关酶、BDNF表达和海马神经发生产生变化,且上述改变可持续至成年期。5.2 5-AzaD通过调节甲基转移酶的水平,降低前额叶皮层和海马中BDNF启动子Ⅳ的高甲基化,并且改善经历青少年期CUMS的成年小鼠的抑郁样行为、BDNF表达和神经发育。