糖尿病是一种慢性代谢类疾病,当机体无法产生胰岛素或人体不能有效利用胰岛素时,就会导致糖尿病的发生。可直接降低血糖的胰岛素始终是临床治疗糖尿病最主要的药物之一。然而,胰岛素易被蛋白酶降解,在体内的半衰期很短、导致其成药性较差。因此,研究制备可抵抗蛋白酶降解的重组人胰岛素,以此提高胰岛素药物的长效性,对Ⅱ型糖尿病的治疗具有深远意义。1.长效重组人胰岛素衍生物的制备与验证本研究使用分子模拟对接技术,确定了 B17位突变位点,在insulin icodec的设计基础上,设计出含有3处氨基酸突变并且在B29位的赖氨酸上连接一条20C脂肪二酸侧链的长效重组人胰岛素衍生物13-acy。通过大肠杆菌表达系统、蛋白变复性、阴离子交换层析、重组胰蛋白酶酶切、阳离子层析、酰化反应、反相层析,获得高纯度产物13-acy。对13-acy进行分子量检测,同时使用V8酶与高效液相色谱对酰化位置进行验证,结果显示13-acy分子量和酰化连接侧链的位置均正确。结果表明,本研究已成功获得长效重组人胰岛素衍selleck抑制剂生物13-acy。2.长效重组人胰岛素衍生物的降糖作用研究本研究在BABL/c小鼠、SD大鼠、BKS-db/db小鼠和HFD+STZ诱导的糖尿病小鼠体内进行单次皮下给药后血糖监测实验。以胰岛素药物Tresiba和insulin icodec(命名为0-acy)为对照。实验前小鼠可自由采食饮水,给药后BABL/c小鼠和SD大鼠自由采食饮水,而BKS-db/db小鼠和HFD+STZ诱导的糖尿病小鼠限制采食量与采食时间。各组分别皮下注射 Vehicle(10 ml/kg)、Tresiba(0.75 mg/kg)、0-acy(3 mg/kg)或13-acy(3 mg/kg)。结果显示13-acy作用时间显著长于Tresiba,具有insulin icodec相同的降糖效果(BABL/c小鼠体内的作用时间为48h,SD大鼠体内的作用时间为72 h)。为探究重组人胰岛素衍生物抵抗酶切降解的能力,深入挖掘其长效降糖机制,本研究在体外进行抗酶切实验,利用高效液相色谱检测剩余蛋白量。结果显示13-acy的半数降解时间为90 min,与0-acy相同,相比于天然人胰岛素延长了 6倍。为探究联合突变在13-acy在长效降糖中的促进作用,本研究对含有B17突变位点的41-acy,含有B17和B25突变位点的42-acy,含有B17、B25和A14突变位点的13-acy进行降糖实验及抗酶切实验。结果显示,仅B17位点存在突变的41-acy已显著延长降糖作用(BABL/c小鼠体内的作用时间为24h)及抗酶切能力(相比于天然人胰岛素延长了 2倍)。当B25及A14位点进一步改变氨基酸后,长效化作用及抗酶切能力进一步增加。以上数据表明,13-acy在降糖能力上和抵抗酶切效果上均与insulin icodec相当,B17位氨基酸的突变对其长效化降糖起到了关键的作用。3.长效重组人胰岛素衍生物的抗糖尿病作用及机制初探本研究在BKS-db/db小鼠体内进行长达6 w的治疗实验。BKS-db/db小鼠依据体重及随机血糖分为4组,每组6只,分别为:空白组(Vehicle,即生理盐水)、对照组A(Tresiba)、对照组B(0-acy)以及实验组(13-acy)。BKS-wt/wt小鼠6只设置为WT组(Vehicle)。小鼠自由饮水采食,每周测量体重和空腹血糖,并在第3周及第6周对其进行口服糖耐量实验。实验后每组随机选取3只小鼠进行采样,检测小鼠血清中糖化血红蛋白(glycosylViscoelastic biomarkerated hemoglobin A1c,GHbA1c)、甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,T-CHO)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐(creatinine,CRE)的含量,并对小鼠肝脏及肾脏进行病理组织学观察。同时,提取肝脏及肌肉组织mRNA,定量检测糖代谢相关基因的表达。结果表明13-acy可通过刺激糖代谢相关基因Insr、Irs-2、Glut4的表达来降低小鼠血糖,实验组的Irs-2的表达量和Glut4表达量显著高于对照组A、对照组B。小鼠体重、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)及GHbA1c结果表明13-acy对机体具有良好的血糖控制效果,实验组小鼠的体重增减较为平稳,FBG相比初始降低了 37.2%,GHbA1c的总量相较于空白对照组减少了 33.6%。OGTT实验表明13-acy可改善BKS-db/db 小鼠的葡萄糖耐量,血糖曲线下面积(area under the curve,AUC)前 0-120 min值相较于空白对照组,下降了 25.2%。TG和T-CHO及油红O染色结果显示13-acy对脂代谢没有影响。BUN和CRE及肾脏PAS染色结果显示,与空白对照组小鼠相比,实验组小鼠BUN和CRE的显著性降低,BUN下降了 60.5%,CRE下降了 53.9%,肾小球系膜基质、毛细血管袢和基底膜增厚程度减少,点击此处表明13-acy可减缓糖尿病肾的发展进程。综上所述,本研究在insulin icodec的设计基础上,通过突变胰岛素B17位的氨基酸,制备出能显著抵抗酶切降解的重组人胰岛素衍生物13-acy。经单次给药降糖实验和6W药物治疗实验验证,与insulin icodec具有相当的降糖效果,可调节机体糖代谢,改善葡萄糖耐量,减缓糖尿病肾病的发展进程,有望成为每周注射一次的糖尿病药物。