研究目的:阿霉素心脏毒性的核心因素是氧化应激。最初的事件可能是线粒体能量供应相对不足,导致体内平衡调节失衡。作为氧化磷酸化的主要位点,过度的氧化应激会产生许多受损的线粒体,导致电子传输链ROS的急剧生成,多种线粒体保护机制参与了抗DOX应激过程。研究方法:60只健康的19周龄、体重在280-320克之间的雌性SD大鼠从中国北京的斯贝福动物中心获得(资格号码:SCXK(京) 2019-0010)。饲养于青岛大学医学部的动物实验中心的笼子里(每笼5只)。它们被随机分为六组:对照组(C组)、DOX组、EP组、EP+DOX(EP-DOX)组、fk866+EP+DOX(fk866-EP-DOX)组和78c+EP+DOX(78c-EP-DOX)组,每组10只。大鼠可以随意进食,保持在22-24℃的室温下,相对湿度为40-70%,并处于12小时的光/暗周期中。经过一周的适应性饲养后,EP组和EP-DOX组的大鼠进行五天的跑台适应性训练,速度为15m/min,坡度为0°,每次持续15分钟。两天后进行运动方案。EP组进行了三次高强度间歇跑步机运动,每次10分钟,速度为25 m/min(75%VO2max),每次间歇10分钟。EP-DOX组和EP组完成相同的运动方案后,静脉腔内注射DOX(20 mg/kg)。fk866-E购买ErdafitinibP-DOX组在运动方案前30分钟注射NAD+信号阻断剂fk866,而78c-EP-DOX组在运动方案前30分钟注射NAD+信号促进剂。心脏超声检测大鼠心功能变化;戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉取血测心脏损伤标志物变化,取心脏组织,石蜡包埋,制作切片,后续组织学染色进行病理学观察;体外实验检测NMN对DOX的疗效,蛋白免疫印迹探究运动通过NMN信号通路维持线粒体质量控制的确切机制;免疫荧光检测核转录基因在细胞核和线粒体的定位情况。研究结果:与C组相比,DOX注射后射血分数(EF)显著降低(P<0.05),DOX组c TnI水平明显升高(P<0.05)。与DOX相比,EP-DOX可显著降低上述心脏损伤程度(P<0.05)。Masson染色显示,DOX组蓝色胶原纤维明显增多,心肌纤维化明显(P<0.05)。与DOX组相比,EP-DOX组纤维化程度明显改善(P<0.05)。HE染色显示DOX组间质间隙有增大的趋势(P<0.05)。DOX组线粒体裂变蛋白水平升高,与DOX组相比,EP-DOX显著降低了Drp1的表达(P<0.05),检测线粒体融合蛋白OPA1和Mfn1/Mfn2的表达,与C组相比,DOX组Mfn1/Mfn2表达明显降低,EP组Mfn1/Mfn2表达明显升高,FK866抑制Mfn1/Mfn2的表达,而78C有效促进线粒体中OPA1和Mfn2的表达。DOX显著下调了PINK1和Parkin的蛋白表达。与DOX相比,EP-DOX显著促进线粒体PINK1/Parkin的表达和转运。与C组相比,DOX组LC3II/LC3I比值降低,P62表达明显升高,而EP则减弱了上述变化。FK866引起的P62水平升高提示抑制NMN通路导致自噬功能障碍,EP通过抑制dox诱导的PINK1/Parkin的下调,也抑制了下游靶点如PGC1-α和TFAM的下调。DOX增加凋亡相关蛋白Caspase 3的表达,刺激BAX、Bnip3等蛋白的表达,同时抑制Bcl-2的表达。DOX暴露后线粒体功能蛋白VDAC也上调,表明其参与孔隙形成并增加线粒体通透性。NAD+线粒体转运蛋白SLC25A51在DOX暴露后下调,EP有效促进其表达。使用MCF-7乳腺癌细胞系和荷瘤小鼠进行的验证实验表明,EP介导的促进NMN合成并没有降低DOX的抗癌作用(P<0.05)。为探讨NMN本身对DOX诱导的心脏毒性的治疗作用,我们用不同剂量的NMN对H9c2大鼠心肌细胞进行了实验。CCK-8检测结果显示,5μM DOX对H9c2心肌细胞的杀伤率约为50%(P<0.05)。20μM NMN处理后的保护作用与DEX相似(P<0.05)。接下来,JC-1被用于评估线粒体活性和功能,结果显示DOX可引起线粒体功能障碍,DEX和NMN联合治疗可显著抑制线粒体功能障碍(P<0.05)。GSH结果显示,NMN+DOX组GSH含量增加,而DOX+DEX组GSH含量没有增加,说明NMBio digester feedstockN和DEX的保护机制存在差异(P<0.05)。此外,与C组相比,DOX组ATP水平显著降低(P<0.05)。与C组相比,DEX和NMN明显恢复了ATP水平,但DEX组的ATP水平略低于C组(P<0.05),说明DEX本身对H9c2心肌细胞有一定的副作用。O2K呼吸计系统测量细胞呼吸速率和线粒体膜电位,结果表明,使用呼吸链抑制剂后,C组整体呼吸速率降低,膜电位去极化。虽然DOX组的初始呼确认细节吸速率明显高于C组,但对化疗的反应更明显降低,说明线粒体呼吸功能对应激的抵抗力较弱。NMN+DOX组的斜率没有明显下降。Western blotting观察蛋白表达,发现DOX组ROCK-1水平明显低于C组,但与NMN共处理后ROCK-1水平上调(P<0.05)。此外,DOX可降低PGC-1α水平,但与NMN共处理不影响PGC-1α水平(P<0.05)。Sirt1水平呈现与PGC-1α相似的趋势,但NMN+DOX组中加入NMN后Sirt1水平较DOX组升高。Nrf-2水平也出现与PGC-1α相似的变化(P<0.05)。与C组相比,DOX组Nrf-1水平并没有降低。只有NAD+信号下游的ROCK-1参与了NMN介导心脏对DOX的保护机制。与DOX损伤环境中模拟NMN处理的H9c2细胞实验相似,PGC1-α、Sirt3、Nrf2、TFAM的表达水平较C组有不同程度的下降。EP有效促进线粒体生物发生。NAD+激动剂和抑制剂进一步促进或削弱了这种保护作用。探究NAD+信号下游转录因子的易位,我们首先比较了Mitotracker荧光斑点的数量与细胞核的数量。DOX组线粒体数量明显多于C组。NMN显著抑制DOX诱导的线粒体裂变(P<0.05)。我们进一步分析了PGC-1α的易位。结果显示,NMN组PGC-1α的核定位率显著低于C组(P<0.05),但线粒体定位率显著升高,提示NMN介导了PGC-1α从细胞核向线粒体的易位。NMN+DOX组核定位率进一步降低,PGC-1α的线粒体定位进一步升高。Nrf2和Sirt3的结果表明,DOX诱导更多的Nrf2从细胞核转移到线粒体。与NMN共处理抑制了这种易位,导致Nrf2定位于细胞核(P<0.05),更多的Sirt-3定位在C组的线粒体中。DOX处理不影响Sirt-3的核表达,但降低了线粒体中Sirt-3的比例。与DOX组相比,NMN+DOX组细胞核和线粒体中Sirt-3的表达均显著升高(P<0.05)。我们通过组织荧光双染色进一步证实了PGC-1α、Nrf2和Sirt3在线粒体中的共定位。与C组相比,DOX组这些蛋白在线粒体中的共定位明显减少,而EP-DOX组则显著改善了它们的共定位。与EP-DOX组相比,FK866显著抑制了这些蛋白在线粒体中的定位,而78C则有效促进了它们的定位。研究结论:本研究揭示了运动预适应对药物诱导心肌损伤具有保护作用的机制。这种保护作用可能与NMN介导的线粒体质量控制有关。这些结果提供了一个新的视角,以及可能指导开发新的保护性策略来预防药物诱导的心脏损伤。