研究目的:Atg2是自噬的重要因子之一。近年来,有研究指出Atg2将隔离膜的边缘系在内质网上,介导ER内质网向隔离膜的直接脂质转移,促进隔离膜的扩张,为自噬体的形成提供磷脂,对自噬体的形成至关重要。同样,运动作为一种可行的非药物治疗方法,有可能扭转和增强随着年龄增长而恶化的自噬作用。不同的运动模式,如开始运动的年龄、时间或者强度,可能对自噬相关蛋白的表达有异质性的影响。长期的有氧运动可以调节自噬相关蛋白,诱导骨骼肌自噬,并延缓肌肉质量的损失。然而Atg2表达在骨骼肌中的作用以及联合运动在延缓骨骼肌和心脏衰老中的表现仍不清楚。因此,为了确定Atg2基因、运动在骨骼肌衰老的影响及其分子机制,以GSK1349572及在心脏功能中的作用,我们对肌肉Atg2基因结合耐力运动进行了实验探究。旨在为增龄性机体功能衰退的运动联合基因疗法提供理论基础和新思路。研究Ferrostatin-1体内实验剂量方法:围绕研究对象创设实验条件,控制干预措施,对研究对象实施具体的研究。通过检索PubMed、Web of science数据库,以自噬、Atg2、骨骼肌衰老、心脏衰老等关键词,查阅了大量学术论文。本研究选用遗传学的经典模式生物果蝇作为研究对象。通过杂交构建Atg2-UAS/mhc-Gal4系统可以实现Atg2基因差异性表达调控,雄性Atg2-UAS-OE果蝇与雌性mhc-Gal4果蝇杂交,收集F1代Atg2-UAS-OE>mhc-Gal4雄性果蝇,分为Atg2过表达组(Atg2-OE组)和Atg2过表达运动组(Atg2-OE+E组)。雄性Atg2-UAS-RNAI果蝇与雌性mhc-Gal4果蝇杂交,收集F1代Atg2-UAS-RNAI>mhc-Gal4雄性果蝇,分为Atg2敲减组(Atg2-RNAI组)和Atg2敲减运动组(Atg2-RNAI+E组)。为消除遗传背景对实验的影响,以Atg2-UAS-OE雌雄自交和Atg2-UAS-RNAI雌雄自交的F1代雄性果蝇作为基因对照组,为Atg2正常表达组(过表达基因对照Atg2-UAS组、敲减基因对照组Atg2-UAS1)和Atg2正常表达运动组(过表达基因对照运动组Atg2-UAS+E、敲减基因对照运动组Atg2-UAS+E1)。另外添加mhc-Gal4对照组,mhc-Gal4雌雄自交的F1代作为Gal4对照组,为Gal4基础对照组(Gal4)。首先对肌肉Atg2基因正常表达果蝇进行耐力运动干预,观察其肌肉Atg2基因表达、氧化应激、脂质代谢及心脏功能的变化,以确定耐力运动在预防和改善骨骼肌衰老和心脏功能障碍的同时是否伴随肌肉Atg2基因表达的变化。然后,利用mhc-Gal4/USA系统构建肌肉Atg2基因差异性表达品系果蝇,并对其进行耐力运动干预,以论证肌肉Atg2基因和耐力运动在预防和改善骨骼肌衰老和心脏功能障碍中的作用。采用SONY摄像机拍摄果蝇震落至培养瓶底部后的负趋地性爬行的行为学特征,测量攀爬指数评定果蝇运动能力。在特制的果蝇耐力训练器上进行果蝇力竭时间的测定。M-mode心动图检测心脏功能(收缩直径、舒张直径、收缩分数、收缩间期、舒张间期、心动周期和心率)的变化。通过Elisa蛋白检测检测肌肉丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活力,以此判断骨骼肌的氧化应激以及脂质积累水平。qRT-PCR检测肌肉相关基因mRNA表达情况,判断肌肉Atg2等相关基因表达情况,分析通路活性。利用HAYEAR和ToupView软件对所获得的果蝇攀爬和心脏相关图片进行数据统计,在Prism软件中利用独立样本t检验等有关统计量的计算来对实验所取得的数据和测量、调查所获得的数据进行有关分研究得到所需结果。利用AVS Video Editor视频分析软件,以果蝇为研究对象,通过对实验果蝇的部分攀爬录像以及心脏录像进行观察统计,收集记录数据。研究结Medicopsis romeroi果:结果表明,肌肉Atg2基因过表达/敲减可以提高/降低果蝇的运动能力,改善/损害心脏功能。耐力运动联合肌肉Atg2基因过表达可进一步提高果蝇的运动能力。耐力运动也可减弱Atg2下调诱导的运动机能下降。耐力运动联合Atg2差异性表达对于心脏功能的影响并不显著。另外,耐力运动可以提高Atg2/AMPK/Sirt1/PGC-1α通路活性,并可减弱Atg2下调诱导的氧化应激和脂质积累。肌肉Atg2基因过表达也提高了Atg2/AMPK/Sirt1/PGC-1α通路活性。耐力运动联合肌肉Atg2基因过表达激活并进一步增强了Atg2/AMPK/Sirt1/PGC-1α通路活性。研究结论:肌肉Atg2基因过表达能够延缓果蝇骨骼肌衰老,改善心脏功能性衰退,延长果蝇寿命。而肌肉Atg2基因敲减则与肌肉Atg2基因过表达作用相反。此外,耐力运动不管是在改善肌肉Atg2基因敲减,还是联合肌肉Atg2基因过表达时,对于果蝇心脏功能的调节效果都没有那么显著。同时,肌肉Atg2过表达与耐力运动联合也增强了增龄果蝇逆重力攀爬能力,提高了其运动能力,并且延寿效果更好,表明二者对增龄果蝇抗衰老产生了叠加效应。并且,肌肉Atg2基因与耐力运动调节MROS的分子机制与Atg2/AMPK/Sirt1/PGC-1α通路活性有关。肌肉Atg2的过表达/敲减还能上调/下调bmm基因的表达,抑制/促进脂质的积累。此外,我们还发现了肌肉Atg2基因表达可能还受AMPK/mTOR/ULK1通路的调控,参与自噬体形成过程中的脂质转移,对于维持自噬的正常运行也有一定的作用。