以非粮原料作为生物乙醇生产的原料,不仅能从根本解决生物制造产业“与民争粮”、“与畜争饲”的问题,同时也是实现“碳中和”目标的重要途径。糖蜜是制糖工业中形成的工业废料,多用于饲料、酵母、味精、有机酸等各类产品的生产;由于其含有大量的蔗糖和还原糖等可发酵糖,十分适合作为微生物的发酵原料。目前微生物糖蜜发酵在绿色生物合成中的应用研究,主要集中在对高效利用菌株的改造及发酵条件的优化。运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是耐高糖高乙醇的革兰氏阴性细菌,能够以葡萄糖、果糖和蔗糖为原料,通过其独特的Entner-Doudoroff(ED)代谢途径厌氧发酵生产乙醇,是以糖蜜为原料进行乙醇发酵的良好底盘。虽然已经证实Z.mobilis可利用糖蜜进行乙醇生产,然而糖蜜中过高的糖浓度以及潜在的抑制物等因素抑制了Z.mobilis的生长及对可发酵糖的高效利用。针对糖蜜的高效利用,本研究评估了Z.mobilis 8b对不同碳源(糖蜜、蔗糖、葡萄糖、果糖)的利用能力,结果表明8b不仅对糖蜜利用能力较差,其对果糖的利用也受到一定程度的抑制。由于糖蜜中可发酵糖以蔗糖为主,且蔗糖进一步被水解为葡萄糖和果糖供Z.mobilis利用,因此本研究采取适应性实验室进化(Adaptive laboratory evolution,ALE)策略,在糖蜜、蔗糖及果糖培养基中进化糖蜜高效菌株,其中果糖高效利用突变株8b-F74同时表现出对糖蜜的高效利用;表明果糖利用劣势是限制Z.mobilis高效利用糖蜜的关键因素。为探究果糖高效利用突变株8b-F74高效利用糖蜜的分子机制,本研究对8b-F74进行了全基因组重测序以及不同碳源培养条件下的RNA-Seq转录组学研究。基因组重测序显示glf(ZMO0366)基因第99号密码子发生错义突变;结合分子动力学模拟及实验验证证明ZMO0366编码的葡萄糖促扩散蛋白Glf突变后与果糖结合的结构稳定性提升,从而使8b-F74的果糖利用能力增强。RMLN8237NA-Seq结果表明,糖蜜培养基中8b-F74参与固氮、磷酸转运等途径的基因表达显著上调,推测其可能为8b-F74对缺乏氮、磷元素糖蜜培养环境做出的适应性进化。此外,在所有碳源条件下8b-F74编码碳水化合物孔蛋白的基因表达上调、编码噬菌体休克蛋白的基因表达下调,这些变化可能会增加细胞外膜和内膜对碳水化合物的通透性,从而增强Z.mobilis对可发酵糖的运输能力,最终表现为8b-F74对高浓度糖的利用能力提升。Sac B和Sac C是Z.mobilis最主要的蔗糖水解酶,由于蔗糖是糖蜜中含量最高的可发酵糖,但Sac B在以蔗糖为底物时会产生果聚糖,从而降低了发酵过程中的乙醇产量。为进一步提高8b-F74蔗糖发酵下的乙醇产量,本研究敲除编码Sac B的基因sac B(ZMO0374)消除果聚糖合成对碳源的争夺,同时过表达sac C以消除Sac B缺失导致的蔗糖水解力下降,最终成功构建了可快速高效发酵糖蜜生产乙醇的重组菌株F74-B~-C~+,其在1/5稀释糖蜜溶液中的糖消耗量由8b的71.71 g/L增至88.26 g/L,乙醇滴度由8b的31.11 g/L增至40.85 g/L,乙醇产率由8b的0.97 g/L/h增至1.70 g/L/h。综上所述,本研究通过Z.mobilis 8b在糖蜜、蔗糖、果糖中的适应性实验室进化,在果糖培养基中获得了一株可以高效发酵糖蜜的突变株8b-F74。通过对8b-F74的组学数据分析,发现了glf(ZMO0366)的突变以及编码固氮途径、磷酸转运体系、外膜孔蛋白、噬菌体休克蛋白等相关基因的差异表达可能是突变株8b-F74高效利用糖蜜确认细节的原因。本研究也通过代谢工程对突变株8b-F74的蔗糖代谢途径进行了优化,敲除sac B的同时过表达sac C,最终获得了一株可以快速高效发酵糖蜜生产乙醇的重组菌株F74-B~-C~+。此外,本研究所获得的Z.mobilis在糖蜜中的组学数据为进一步immediate effect探究影响Z.mobilis在不同环境生长与生产的分子机制提供了丰富的组学数据;同时,Glf突变增强果糖转运能力等结果也为以运动发酵单胞菌为底盘细胞构建高效细胞工厂提供生物元件。