目的:探讨受体酪氨酸激酶Axl在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠(EAE)中的保护作用和对小胶质细胞铁死亡的调控作用,以及达拉菲尼(DA)对EAE小鼠铁死亡相关神经炎症的治疗作用,了解Axl与铁死亡的关系,为小分子化合物靶向治疗多发性硬化(MS)乃至神经退行性疾病的研究奠定基础,为MS治疗寻找新靶点。方法:1.采用C57BL/6小鼠为实验动物,EAE小鼠模型为MS疾病的动物模型,初步验证该药是否对EAE小鼠具有治疗作用并延缓小鼠的疾病进展。2.采用BV2小鼠小胶质细胞为实验细胞,并用LPS和Erastin构建细胞模型,首先检测细胞活力确定DA的最佳干预浓度和最佳干预时间,并用流式细胞术检测各组细胞周期、ROS以及JC-10水平,其次用免疫荧光检测M1/M2型胶质细胞的表达以及Axl与M1型细胞的表达,最后用WB检测神经炎症相关蛋白的表达,明确DA对Axl以及BV2细胞炎症功能的影响。利用LPS和Erastin共同诱导BV2细胞,并用流式细胞术检测各组细胞周期和ROS水平,荧光显微镜观察各组细胞的JC-10水平,WB检测铁死亡相关蛋白的表达,透射电镜观察各组细胞的超微结构,最后用分子对接预测DA与GPX4的结合模式,明确DA对铁死亡相关神经炎症的治疗作用。3.采用Axl基因敲除小鼠为实验动物,EAE小鼠模型为MS疾病的动物模型,通过WB、免疫荧光检测Axl及铁死亡相关蛋白的表达,免疫组化检测不同组小鼠ACwww.selleck.cn/products/imidazole-ketone-erastinSL4、GPX4蛋白的表达,明确DA通过上调Axl抑制小胶质细胞铁死亡减轻EAE炎性脱髓鞘的保护作用。结果:1.在EAE小鼠中,H&E染色结果显示炎症细胞浸润,Weil染色结果表明神经髓鞘脱失;免疫组化结果发现ACSL4阳性细胞数表达增多,GPX4阳性Polygenetic models细胞数表达减少;免疫荧光结果显示ACSL4与IBA-1表达均上调,这提示EAE小鼠中可能存在铁死亡相关的神经炎症,铁死亡PF-02341066的出现可能由小胶质细胞介导。DA治疗缓解EAE小鼠的临床症状,降低神经功能评分,减轻EAE小鼠体内的炎症反应,并抑制EAE中的铁死亡过程。2.在LPS诱导的炎症模型中,DA治疗促进BV2细胞向M2型细胞转化,阻滞细胞S期、抑制ROS反应,恢复线粒体功能,并通过上调Axl激活P-JAK2、P-STAT3的表达,从而抑制炎症反应,起到治疗作用。相比于Erastin组,LPS与Erastin共同诱导的细胞模型中铁死亡更加严重,而DA的治疗阻滞细胞S期,抑制ROS产生,恢复线粒体功能,并上调Ferritin、GPX4、System x C-的表达、下调ACSL4、CD71、POR的表达,降低了细胞内脂质过氧化程度,显著抑制细胞铁死亡。通过分子对接模拟DA与GPX4的结合模式,发现两者以氢键结合,DA可能通过GPX4抑制细胞铁死亡。上述研究说明,DA的神经保护作用与抑制炎症反应和铁死亡有关,并可能通过受体酪氨酸激酶Axl受体介导。3.相比于EAE组,Axl~(-/-)+EAE组小鼠的症状更严重,神经功能评分更高,死亡率增加,铁死亡更严重;WB结果显示Ferritin、System x C-、GPX4显著下降,CD71、ACSL4、P450显著上升;免疫组化结果表明ACSL4阳性细胞数表达增高,而GPX4阳性细胞数表达较少;免疫荧光结果显示ACSL4与IBA-1表达上调,这说明Axl通过促进小胶质细胞铁死亡加重了EAE小鼠的症状。DA治疗组小鼠的神经功能评分下降,症状减轻,Axl表达上调,铁死亡相关蛋白表达水平降低,这说明DA通过上调Axl调节铁死亡相关蛋白的表达,影响细胞内铁代谢水平和脂质过氧化水平,从而抑制小胶质细胞铁死亡。上述研究表明DA通过作用于Axl受体抑制小胶质细胞铁死亡从而对EAE产生神经保护作用。结论:1.Axl基因敲除后EAE小鼠的炎症反应和铁死亡程度均加重;2.Axl通过抑制小胶质细胞铁死亡缓解EAE小鼠炎性脱髓鞘;3.DA通过上调Axl的表达抑制小胶质细胞铁死亡对EAE小鼠铁死亡相关神经炎症产生治疗作用。