研究背景肿瘤的化疗抵抗是当前肿瘤治疗面临的一大难题。肿瘤出现化疗抵抗的主要原因之一是肿瘤在发展过程中内部出现的乏血供乏氧微环境。Laboratory Refrigeration肿瘤的血流灌注不足,不仅会影响化疗药物进入肿瘤组织,其造成的乏氧状态还会降低化疗药物的治疗效果。因此,改善肿瘤的血流灌注、促进化疗药物的瘤内递送将成为提高肿瘤化疗疗效的潜在解决方法。已有研究证实,低强度的超声激励微泡(ultrasound stimulated microbubbles,USMB)发生稳态空化,能暂时提高肿瘤的血流灌注,促进肿瘤的化疗释药,提高化疗效果。超声微泡空化治疗增强肿瘤血流灌注的机制尚不完全明确,此外,其效应受多重因素的共同影响,是一个复杂的过程。许多研究致力于比较超声联合微泡治疗的各项参数条件,以优化其促进肿瘤化疗释药的效果,然而,却还未见系统性研究探索超声联合微泡治疗在化疗过程中的介入时机这一关键因素。本实验建立了兔VX2肌内移植瘤模型,通过比较不同USMB治疗和化疗的时序组合下肿瘤内药物浓度的差异,以探索最佳的超声微泡空化治疗的介入时机。随后,进一步通过长期、多次联合治疗,探索最优时序组合的联合治疗方式增强肿瘤化疗的生物效应。目的1.探索超声联合微泡治疗在化疗中的最佳介入时机,使其能达到最大促进化疗释药作用;2.进行多疗程的超声微泡空化治疗联合肿瘤化疗,观察其对肿瘤生长的抑制作用;3.观察多次超声微泡空化治疗联合化疗后肿瘤内相关细胞因子和内部结构改变,进一步探究其可行性及可能的机制。材料与方法1.主要实验仪器飞依诺数字化彩色超声诊断仪VINNO 70,高频线阵探头X4-12L(频率范围为4～12 MHz)。2.主要实验试剂2.1“脂氟显”超声造影剂。2.2盐酸吉西他滨。2.3荧光素钠。3.实验动物新西兰大白兔75只,体重2.0～2.5 kg,雌雄不限。4.实验方法实验一:超声联合微泡促进肿瘤化疗药物递送的最佳时机研究(1)动物模型的构建:选择实验兔任意侧大腿内侧建立兔VX2肌内移植瘤模型,肿瘤直径约1 cm时开始进行实验;(2)分组及处理:60只荷瘤兔随机分为五个治疗组(A-E)和一个对照组(F),每组各8只接受10分钟的吉西他滨(gemcitabine,GEM)静脉化疗,各2只接受荧光素钠灌注代替。各治疗组还进行20分钟的超声联合微泡治疗。A组和B组分别在化疗结束10分钟后和化疗结束后即刻开始进行超声联合微泡治疗;C组和D组分别在超声治疗的前半程和后半程同时进行化疗;E组则在超声联合微泡治疗结束后立即开始化疗。每组实验兔在治疗前后均进行肿瘤超声造影,储存动态视频以备后续定量分析。各组均于化疗结束40分钟后处死实验兔,取下肿瘤组织,采用高效液相色谱法测量肿瘤内GEM浓度,在荧光显微镜下观察肿瘤内荧光素钠分布。实验二:超声联合微泡增强肿瘤化疗的生物效应研究(1)动物模型的构建:同上。(2)分组及处理:15只荷瘤兔随机分为3组,每组各5只:USMB+GEM组、GEM组及对照组。各组实验兔每周均接受一次治疗,连续治疗三周后间隔FG-4592溶解度一周,再连续治疗三周,共接受六次治疗。USMB+GEM组每次接受吉西他滨化疗和20分钟超声联合微泡治疗,GEM组只接受吉西他滨化疗,对照组接受等量生理盐水灌注。各组每次治疗前均应用超声测量肿瘤大小。各组于最后一次治疗结束24小时后处死实验兔,取下肿瘤组织,进行Ki67免疫荧光染色观察肿瘤细胞增殖情况;TUNEL法检测细胞凋亡;酶联免疫吸附试验测量肿瘤内HIF-1α,VEGF,TNF-α和TGF-β等细胞因子的含量;HE染色和透射电镜观察肿瘤的微细结构改变。结果实验一:超声联合微泡促进肿瘤化疗药物递送的最佳时机研究(1)肿瘤血流增强效应:各治疗组经USMB治疗后肿瘤血流灌注明显增强,定量分析结果显示治疗前后肿瘤血流灌注强度有统计学差异(P<0.05)。对照组肿瘤血流灌注无明显变化。(2)时机选择:高效液相色谱法测量A-F组肿瘤内GEM浓度值分别为1919.5±798.5 pg/mg,2541.0±994.0 pg/mg,1826.4±1111.1 pg/mg,1815.6±717.2 pg/mg,1479.3±545.9 pg/mg,898.0±316.9 pg/mg。其中B组即在化疗结束后立即进行超声联合微泡治疗组肿瘤内药物浓度最高。荧光显微镜下观察荧光素钠在肿MLN4924供应商瘤内的分布可见B组肿瘤内荧光素钠的强度更高。实验二:超声联合微泡增强肿瘤化疗的生物效应研究(1)肿瘤生长抑制:经过六次联合治疗后,USMB+GEM组的肿瘤生长显著慢于GEM组和对照组(P<0.05)。USMB+GEM组的Ki67阳性细胞率低于GEM组,且显著低于对照组(P<0.05)。TUNEL染色提示USMB+GEM组的凋亡细胞较其余两组显著增多(P<0.05)。(2)相关细胞因子含量:经过六次联合治疗后,USMB+GEM组肿瘤内HIF-1α和VEGF含量显著低于其余两组(P<0.05)。USMB+GEM组肿瘤内TNF-α和TGF-β的平均含量略低于GEM组,而这两组的含量均显著低于对照组(P<0.05)。(3)肿瘤微细结构变化:光镜下观察HE染色切片未发现三组的肿瘤组织有明显的出血、血管破裂等损伤。透射电镜下发现USMB+GEM组的肿瘤微血管基底膜变厚呈多层叠加状态,而GEM组和对照组的肿瘤微血管基底膜薄且不连续。结论1.超声联合微泡治疗可以增强肿瘤的血流灌注及化疗药物递送,且其最佳介入时机为静脉化疗结束后即刻;2.超声联合微泡治疗可以显著增强化疗对肿瘤的生长抑制作用,改善化疗疗效;3.多次进行超声微泡治疗联合化疗会改变肿瘤内相关细胞因子含量及肿瘤组织部分微细结构,可能有助于改善肿瘤内部缺氧和抑制异常的血管增生,进一步提高化疗的疗效。