肿瘤尤其是恶性肿瘤严重威胁人类生命健康。寻求新的治疗方法,进一步提高肿瘤治疗效果,是亟待解决的重大问题。肿瘤免疫治疗通过多种方式建立抗肿瘤免疫反应,实现抑制和杀伤肿瘤细胞的目的,已在临床得到应用,并在部分难治性肿瘤中获得显著治疗效果,为彻底治愈肿瘤带来了新希望。肿瘤疫苗是一种极具发展潜力的肿瘤免疫治疗方式,通过主动递送肿瘤抗原激活特异性抗肿瘤免疫反应,进而实现对肿瘤细胞的特异性清除。及时识别并杀灭新出现的肿瘤细胞,避免细胞增殖转移是有效预防肿瘤的关键,但预防性肿瘤抗原筛选困难、刺激细胞免疫的佐剂有限、淋巴结靶向性不足、免疫时间滞后等问题,制约了肿瘤疫苗的发展。开发携带预防性肿瘤抗原、可有效激活抗肿瘤免疫反应的肿瘤疫苗,并利用肿瘤疫苗提前赋予机体对未来可能出现肿瘤的预防能力,是预防肿瘤复发转移的有效措施。本研究立足于肿瘤疫苗开发中的限制性因素,基于免疫学及超声原理,以乳腺癌为模型,制备了以可变剪接扰动后的肿瘤细胞膜蛋白和RNA为抗原、超声增强抗原提呈的纳米级肿瘤疫苗,为肿瘤疫苗设计提供了新方案。目的1.探索并创建以肿瘤细胞膜蛋白及RNA为抗原,同时携带声敏剂二氢卟吩e6(Chlorin e6,Ce6)的肿瘤疫苗制备方法,为肿瘤疫苗设计提供新方案。2.研究超声的声动力作用对抗原提呈细胞(Antigen-presenting cells,APCs)加工处理疫苗能力的影响及相关机制。3.探索负载可变剪接扰动细胞来源抗原的肿瘤疫苗制备方法,评估其在预防肿瘤复发转移中的作用。方法1.肿瘤疫苗制备及安全性评价使用差速离心法提取小鼠4T1乳腺癌细胞的细胞膜,利用考马斯蓝染色法检测细胞膜蛋白与全细胞裂解液中的蛋白表达情况,并利用Western blot技术检测细胞膜蛋白标志物的表达。使用Trizol法提取肿瘤细胞的总RNA,利用琼脂糖凝胶阻滞实验探讨多聚赖氨酸(Poly-L-lysine,PLL)浓缩RNA的合适比例。采用复乳法,以溶有Ce6和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)的二氯甲烷溶液为外部油相,以含有细胞膜蛋白、RNA的水溶液为内部水相,制备共装载细胞膜蛋白、RNA及Ce6的纳米颗粒CM-RNA@Ce6/PLGA(即肿瘤疫苗)。电子显微镜观察纳米颗粒的大小及形态,粒径分析及Zeta电位检测粒径分布与纳米颗粒分散性。使用BCA法检测蛋白含量,紫外—可见分光光度法检测RNA及Ce6的含量。通过检测悬液中肿瘤疫苗在不同时间点的粒径及Zeta电位变化,评估肿瘤疫苗的稳定性。为了评估肿瘤疫苗的安全性,将制备的肿瘤疫苗皮下注射入雌性BALB/c小鼠体内,12小时后使用1 W/cm~2强度的超声辐照接种部位附近的淋巴结。间隔5天,进行第二次免疫,共免疫3次。免疫完成后,利用超声心动图检测小鼠心功能,血生化及组织HE染色评估小鼠肝肾功能及主要器官的病理学改变。2.声动力对抗原提呈的影响为评估肿瘤疫苗皮下注射后在小鼠体内的分布情况,制备Di R和Di O标记的肿瘤疫苗。在小鼠皮下注射Di R标记的肿瘤疫苗,使用活体荧光成像在器官水平检测肿瘤疫苗在淋巴结和主要脏器的分布;在小鼠皮下注射Di O标记的肿瘤疫苗,制作不同器官的组织冰冻切片,使用激光共聚焦显微镜在组织水平检测肿瘤疫苗分布。为评估肿瘤疫苗是否可以被细胞高效内吞,将肿瘤疫苗与DC2.4细胞共培养,利用激光共聚焦显微镜成像在细胞水平检测肿瘤疫苗与细胞共定位。将Di O标记的肿瘤疫苗皮下注射入小鼠体内,使用流式细胞术检测淋巴结中内吞肿瘤疫苗的细胞数量。为研究声动力对肿瘤疫苗内体/溶酶体逃逸的影响,将肿瘤疫苗与DC2.4细胞共培养,激光共聚焦显微镜检测不同时间点以及声动力处理后肿瘤疫苗与溶酶体的共定位。分别使用荧光素酶表达载体和e GFP表达载体转染HEK293T细胞,收集RNA,分别制备含有荧光素酶RNA或e GFP RNA的纳米颗粒。将纳米颗粒与DC2.4细胞共培养,施加声动力处理,通过检测细胞中荧光素酶或e GFP表达,研究声动力对疫苗中携载RNA表达效率的影响。以卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)为模式抗原,用于分析抗原提呈效率。使用OVA表达载体转染HEK293T细胞,提取细胞膜和RNA,制备以OVA为抗原的纳米颗粒。将纳米颗粒与DC2.4细胞共孵育12小时后,使用强度为1 W/cm~2的超声辐照细胞1min,继续培养细胞48小时。使用流式细胞术检测表达DC成熟标志物CD80/86的细胞比例,评估声动力对DC成熟的影响;使用流式细胞术检测提呈SIINFEKL表位的细胞比例,评估声动力对抗原提呈的影响。为评估肿瘤疫苗效果,使用装载不同抗原成分的纳米颗粒对BALB/c小鼠进行三次免疫,免疫完成后使用4T1细胞在小鼠乳腺原位荷瘤,监测肿瘤生长情况。荷瘤21天后对小鼠实施安乐死,流式细胞术和免疫荧光染色检测不同处理组肿瘤组织中T细胞浸润情况。3.携带可变剪接扰动肿瘤细胞来源抗原的肿瘤疫苗制备及疗效评价为模拟肿瘤演变中可变剪接的改变,构建丝氨酸/精氨酸富集剪接因子1(Serine/arginine-rich splicing factor 1,SRSF1)过表达细胞系或使用剪接调节剂Pla B(Pladienolide B,Pla B)处理细胞。使用二代转录组测序分析细胞不同可变剪接模式的改变,利用q PCR检测代表性m RNA的可变剪接改变。划痕实验和细胞增殖实验用于检测过表达Srsf1后4T1细胞的迁移和增殖能力。使用对照及Srsf1过表达4T1细胞在小鼠原位荷瘤,监测肿瘤体积变化,使用流式细胞术和免疫荧光染色分析肿瘤组织T细胞浸润,评价肿瘤免疫biological optimisation状态。利用可变剪接扰动后的肿瘤细胞成分制备肿瘤疫苗,在小鼠皮下进行三次免疫,免疫结束后使用4T1细胞原位荷瘤。检测肿瘤体积变化,评价肿瘤疫苗对肿瘤生长的抑制作用;使用流式细胞术和免疫荧光染色分析浸润T细胞数量,评估疫苗免疫对肿瘤免疫微环境的影响;计数肺部肿瘤转移灶数量,评价疫苗对肿瘤转移的预防效果。结果1.成功构建共装载肿瘤细胞膜蛋白、RNA及Ce6的肿瘤纳米疫苗。提取的细SCH727965小鼠胞膜中膜标志物Na~+/K~+ATP酶和钙黏蛋白高表达,胞质蛋白GAPDH表达量很低,证明细胞膜提取成功。琼脂糖凝胶阻滞电泳结果表明当PLL与RNA的氮磷比(N/P)最佳参数为2.5时,RNA被PLL有效浓缩。使用复乳法成功构建携载细胞膜蛋白、RNA及Ce6的纳米颗粒,电镜、粒径及Zeta电位分析的结果表明构建的纳米颗粒分散性良好,平均粒径为173.8±10.4 nm,Zeta电位为-26.32±1.54mv。当内部水相体积为300μl,膜蛋白和RNA质量为600μg;油相体积为1 ml,Ce6为4 mg时,蛋白质、RNA及Ce6的包封率分别为68.3±2.7%、31.5±3.5%、15.2±2.5%。该纳米颗粒在PBS中稳定性良好,72 h内粒径及电位无显著性变化。小鼠接受三次免疫后,心功能及肝肾功能正常,与对照组无显著变化,主要器官无明显病理损伤。2.超声联合肿瘤纳米疫苗处理抑制肿瘤生长活体荧光成像及激光共聚焦显微镜成像结果表明,皮下注射的肿瘤疫苗可以在淋巴结富集,少量可以在肝、肺和肾等脏器被检测到。激光共聚焦显微镜成像结果表明与细胞共孵育后肿瘤疫苗可以被细胞有效内吞。肿瘤疫苗与细胞共孵育后,使用激光共聚焦显微镜检测发现,随着时间延长,肿瘤疫苗逐渐定位于溶酶体,声动力处理促进了肿瘤疫苗从溶酶体的释放。对细胞荧光素酶和e GFP的表达检测证明,声动力处理提高了纳米颗粒携载RNA在细胞内的表达效率。将携载OVA的纳米颗粒与DC2.4细胞共孵育,声动力处理组成熟DC2.4细胞比例显著升高,并且声动力处理还显著提高了提呈SIINFEKL表位的细胞数量。动物实验表明,与装载单一膜蛋白或RNA抗原的纳米颗粒相比,共装载膜蛋白和RNA两种抗原的肿瘤疫苗对肿瘤生长的抑制效果更好。3.携载可变剪接扰动细胞来源膜蛋白和RNA的肿瘤疫苗效果更佳。细胞划痕实验及增殖实验表明,4T1细胞过表达Srsf1后,迁徙和增殖能力显著提高。转录组测序结果表明Srsf1过表达和Pla B药物处理均可以改变肿瘤www.selleck.cn/products/r-gne-140细胞m RNA的可变剪接模式。使用q PCR对典型基因的检测结果进一步证明,过表达Srsf1和Pla B药物处理均可以改变m RNA中内含子保留情况。通过流式细胞术和免疫荧光染色发现,过表达Srsf1后肿瘤局部的免疫微环境得到改善。动物实验表明,与对照肿瘤疫苗相比,携载可变剪接扰动后细胞来源抗原的肿瘤疫苗具有更好的免疫效果,肿瘤生长缓慢,且显著减少了肺部肿瘤转移灶数量。结论1.采用复乳法成功制备了以PLGA为衣壳,共装载肿瘤细胞膜蛋白、RNA及Ce6的肿瘤疫苗CM-RNA@Ce6/PLGA。疫苗的粒径分布均一,稳定性高,生物安全性好。2.皮下注射的肿瘤疫苗可在淋巴结高效富集,声动力促进CM-RNA@Ce6/PLGA在内体/溶酶体逃逸,提高了RNA的表达效率;装载肿瘤细胞膜蛋白、RNA和Ce6三种成分的肿瘤疫苗具有理想的肿瘤抑制效果。3.Srsf1过表达和Pla B药物处理均可以扰动细胞的可变剪接,模拟肿瘤演变过程中可变剪接模式的改变,促进新抗原产生。与对照肿瘤疫苗相比,装载可变剪接扰动后抗原的肿瘤疫苗具有更好的抑制肿瘤生长和预防远处转移的效果。