目的:构建负载骨形态发生蛋白2(bonemorphogeneticprotein-2,BMP-2)的丝蛋白(silk fibroin,SF)/碳纳米笼(carbonnanocages,CNC)复合支架,体外评估该复合支架的缓释性能、生物相容性及成骨诱导效果,体内验证该支架的骨缺损修复性能。方法:1.制备CNC并评估其表征,探究单独应用CNC对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymalstemcells,BMSCs)增殖的作用,评估 CNC 和 BMP-2 单独或联合应用对BMSCs成骨分化及矿化的作用。2.制备SF/CNC复合支架并评估其表征,探究SF/CNC复合支架对大鼠BMSCs的细胞毒性及黏附作用。评估SF/CNC复合支架对BMSCs成骨分化及矿化的影响。3.制备负载BMP-2的多级SF/CNC复合支架并评估其缓释效果。探究nano bioactive glassBMP-2/SF/CNC复合支架对大鼠BMSCs成骨分化的作用及其分子机制。4.构建大鼠颅骨缺损模型,验证BMP-2/SF/CNC复合支架对大鼠颅骨缺损的修复效果。结果:1.场发射扫描电镜(field emission scanning electron microscope,FESEM)显示 CNCTorin 1说明书由尺度较为均一的球状颗粒物组成,其粒径分布呈正态分布,XRD显示CNC具有石墨化结构;CCK-8及活死染色结果显示CNC在0～80 μg/mL的浓度范围对BMSCs无明显细胞毒性;ALP染色及活性实验、茜素红染色和半定量及RT-qPCR结果显示,CNC与BMP-2在成骨诱导方面具有一定的协同效果。2.FEHydrotropic Agents抑制剂SEM表征显示,SF/CNC复合支架材料的内部均有较好立体形态的大孔结构,大孔之间相互连通,直径约为100～200 nm;激光共聚焦显示SF/CNC复合支架促进了BMSCs的黏附性能,其中SF/CNC-1组具有最为理想的细胞黏附性能;CCK-8结果显示不同比例的SF/CNC支架材料对BMSCs无明显细胞毒性;ALP染色显示SF/CNC复合支架较SF组和对照组相比具有更好的成骨诱导性能;ALP活性结果亦显示,SF/CNC-1组的细胞具有最高的ALP活性;RT-qPCR结果显示,3天时,SF/CNC-1组对ALP、BSP、RUNX2和OCN的基因表达有最为显著的上调效果;7天时,SF/CNC-1组对ALP、BSP和OCN的基因表达有最为显著的上调效果。茜素红染色及半定量结果显示SF/CNC-0.1和SF/CNC-1组均可明显提高BMSCs的成骨分化及矿化性能,上调成骨关键蛋白ALP、OCN的表达,其中SF/CNC-1组具有最为理想的促成骨效果。3.缓释实验证实SF/CNC复合支架对BMP-2具有较为理想的缓释行为,24 h时释放率约为23.9%,7天的释放率约为47.7%;RT-qPCR结果显示,3天时,与BMP-2/SF支架相比,BMP-2/CNC和BMP-2/SF/CNC支架可显著上调ALP的基因表达水平,而7天时,ALP、RUNX2和OCN的基因表达均显著上调;与BMP-2/CNC组相比,BMP-2/SF/CNC支架对ALP和RUNX2的基因表达具有更明显的促进效果;ALP染色及活性检测,茜素红染色及半定量结果均显示,BMP-2/SF/CNC支架对成骨分化及矿化具有最为明显的促进效果;Western blot结果显示,BMP-2/SF/CNC支架可通过激活Wnt/β-catenin通路,上调成骨分化关键转录因子RUNX2的蛋白表达水平,进而有效促进成骨分化行为;全转录组测序结果进一步提示BMP-2/SF/CNC复合支架可能通过激活BMSCs中PI3K/Akt/GSK3β/Wnt/β-catenin信号通路,进而促进下游促成骨分化相关转录因子RUNX2等的表达,上调成骨效应蛋白ALP、OCN等,发挥高效的促成骨分化作用。4.Micro-CT三维重建和Masson染色显示,BMP-2/SF/CNC组较其他组相比具有最佳的骨缺损修复效果;Micro-CT定量分析显示,BLANK组、SF组、SF/CNC组、BMP-2/SF组和BMP-2/SF/CNC组的新生骨体积百分比(BV/TV)分别为15.1±0.3%、24.9±2.6%、40.6±3.2%、44.5±4.7%和70.6±4.1%,同时SF组、SF/CNC组和BMP-2/SF/CNC组与BLANK组之间均存在统计学差异,其中BMP-2/SF/CNC组差异最为显著。SF/CNC、BMP-2/SF和BMP-2/SF/CNC组较SF组在BV/TV、Tb.Th及BMD等指标均有显著性提高,而BS/BV则存在显著性降低。免疫组化及荧光双标染色结果显示,BMP-2/SF/CNC组具有显著的促新骨形成效果,同时骨矿化沉积率(μm/day)较对照组相比升高最为显著。结论:CNC不仅具有良好的成骨诱导性能,也可有效缓释BMP-2,通过延长复合材料支架BMP-2的缓释时间和提高BMP-2的生物活性来优化复合支架中BMP-2的功效,最终形成的BMP-2/SF/CNC复合支架具有稳定的物理结构、良好的生物相容性,在体外和体内均体现了较好的协同成骨诱导性能,是一种富有前景的骨修复再生材料体系。