背景介绍前列腺炎是一种常见的泌尿系统疾病,近一半的男性在人生某个阶段中都会出现前列腺炎的症状。Ⅲ型前列腺炎又称慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合症(CP/CPPS),约占前列腺炎病例的90%以上,可导致患者出现盆腔疼痛不适,排尿异常,性功能障碍甚至抑郁等症状,严重medicine re-dispensing地影响了患者的生活质量。由于其病因尚未完全阐明,导致症状反复发作,目前临床上仍缺乏有效的治疗方式。有研究表明自身免疫在Ⅲ型前列腺炎的发病中扮演着重要角色,具有抗炎效果和一定免疫抑制作用的甾体类抗炎药可能是治疗Ⅲ型前列腺炎的重要选择。多项临床研究表明,甾体类抗炎药可以改善Ⅲ型前列腺炎患者NIGW4869供应商H-CPSI和生活质量评分,并有望改善抑郁评分,因此《2022年欧洲泌尿外科协会慢性盆腔疼痛指南》将甾体类抗炎药列为缓解Ⅲ型前列腺炎症状的首选药物,然而长期服用甾体抗炎药易产生严重的副作用,临床上并未得到广泛的使用。鉴于Ⅲ型前列腺炎的复发性和难以治疗性,如何能够实现靶向性递送甾体类抗炎药,减少其在正常组织的分布,进而降低药物的毒副作用,并提高其治疗效果,仍需深入研究。近年来,纳米药物在炎症性疾病的诊断和治疗方面得到了广泛的发展,纳米系统可以通过递送药物或调节炎症微环境来治疗炎症性疾病,但目前少有将纳米药物应用于Ⅲ型前列腺炎的治疗研究。课题组前期研究工作表明,前列腺炎存在氧化应激,其炎症组织中ROS浓度较高,并且炎症性前列腺组织中浸润了大量活化的巨噬细胞,在这些细胞中检测到叶酸受体的过表达。此外,慢性炎症部位微环境呈酸性,巨噬细胞中核内体(p H 5-6)和溶酶体(p H 4-5)也具有较低的p H值,为纳米药物的可控释放和靶向递送提供了适当的微环境。本项目拟利用Ⅲ型前列腺炎炎症组织的微环境特点,合成叶酸修饰的负载地塞米松的p H/ROS响应性纳米药物,靶向递送药物至前列腺炎症组织并进行响应性药物释放,并在细胞水平和动物模型上评价纳米药物的靶向效果和抗炎作用,以期达到减少给药频率、降低给药剂量的目的,旨在解决长期使用甾体抗炎药毒副作用大的问题,为Ⅲ型前列腺炎的治疗提供一种新的策略。研究目的1.根据Ⅲ型前列腺炎炎症部位的微环境特点,构建出叶酸修饰的负载地塞米松的p H/ROS响应性纳米药物,详细评价其理化性质以及是否适合体内应用。2.从细胞层面和动物层面详细研究纳米药物治疗Ⅲ型前列腺炎的靶向效果和抗炎作用,通过纳米系统实现靶向性递药和可控释放,达到减少给药频率、降低给药剂量的目的,进而降低甾体类抗炎药的毒副作用,为Ⅲ型前列腺炎的治疗提供一种新的策略。研究方法1.负载地塞米松的p H/ROS响应性纳米药物的制备与表征使用肉桂醛和4-(羟甲基)苯硼酸频哪酯醇修饰α-环糊精,合成p H/ROS双响应载体。进而制备出空白纳米粒(Blank CA-Oxi-αCD NPs,Blank NPs),负载Dex的纳米药物(Dex/CA-Oxi-αCD NPs)以及叶酸(Folic acid,FA)修饰的负载Dex的纳米药物(Dex/FA-CA-Oxi-αCD NPs)。使用马尔文粒度仪、TEM检测纳米药物的粒径、表面电位、PDI以及形貌特征。利用HPLC检测纳米药物的载药量,以及在不同介质中的释放效能。2.纳米药物体外生物学效应以及抗炎效果评价培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,小鼠前列腺上皮细胞以及人前列腺基质细胞。使用CCK-8法检测纳米药物的细胞毒性,利用激光共聚焦显微镜观察炎症细胞对Cy5标记的纳米药物的摄取能力,使用H_2O_2检测试剂盒检测纳米药物清除炎症细胞胞内外H_2O_2的能力,利用q RT-PCR、WB等方法检测细胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-17A的表达情况。3.纳米药物体内分布以及抗炎效果评价建立小鼠自身免疫型前列腺炎模型,通过尾静脉注射Cy5标记的纳米药物,利用小动物活体成像系统检测纳米药物的体内分布情况,并使用CLSM观察纳米药物进入前列腺腺腔的情况。使用纳米药物治疗前列腺炎小鼠模型,通过小鼠的血常规、肝肾功参数以及观察主要脏器病理改变评价纳米药物的生物安全性,并使用Von-Frey纤维丝测试小鼠的盆腔疼痛情况,通过H&E染色观察小鼠前列腺组织的病理学改CX-5461使用方法变。通过ELISA试剂盒、WB法来检测小鼠血液和前列腺组织炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-17A表达情况。通过免疫组化法检测小鼠脑海马体5-HT1A受体、SERT的表达,以及L5-S1节段脊髓中GFAP的表达。研究结果1.成功制备了负载Dex的p H/ROS响应性纳米药物,TEM结果显示纳米药物为尺寸均一的球形结构,粒度分析结果显示纳米药物的粒径分布在160-180 nm,分散性好,表面电位低,并且具备良好的稳定性。HPLC测得纳米药物载药量约为6%。药物释放实验表明,Dex纳米药物可以在酸性和/或富含ROS的微环境中高效地释放药物。2.细胞毒性实验表明纳米药物相比游离Dex具备更低的细胞毒性。细胞吞噬实验表明,FA修饰的Dex纳米药物可被LPS刺激的巨噬细胞、前列腺上皮细胞和前列腺基质细胞有效内吞。并且纳米药物可以有效降低炎症细胞胞内外H_2O_2的浓度。通过q RT-PCR和WB的方法证实了炎症细胞中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-17A经Dex纳米药物处理后得到了显著的下调。3.体内成像显示FA修饰的纳米药物能靶向前列腺组织并在前列腺腺腔内蓄积。体内治疗实验显示通过检测小鼠血常规、肝肾功以及观察主要脏器病理改变证明纳米药物具有良好的生物安全性。Dex纳米药物可下调小鼠血液和前列腺组织中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-17A的表达,减轻前列腺组织中炎症细胞的浸润,并缓解盆腔疼痛症状。免疫组化法证实了纳米药物可降低模型小鼠脑5-HT1A受体和SERT的表达,以及L5-S1段脊髓GFAP的表达。结论1.成功制备了负载Dex的p H/ROS响应性纳米药物,性质稳定,载药量较高,具有优良的p H/ROS响应效能,适合进一步体内外实验的应用。2.体外细胞实验证明Dex纳米药物拥有更低的细胞毒性,FA修饰的纳米药物可以被前列腺炎症细胞高效吞噬,Dex纳米药物可以有效清除前列腺炎症细胞胞内外的H_2O_2浓度,并显著降低炎症细胞中炎性因子的表达。3.体内动物实验表明FA修饰的纳米药物可以靶向前列腺炎症部位,并拥有更长的体内循环时间。Dex纳米药物具备良好的体内生物安全性,能够缓解小鼠的盆腔疼痛症状,并减轻前列腺组织中炎症细胞的浸润,以及下调模型小鼠血液和前列腺组织中炎性因子的表达,并且可能减轻小鼠抑郁。意义本项目通过制备出具有p H/ROS响应性的负载Dex的纳米药物,详细研究了其在体内外的靶向效果和治疗作用,旨在解决长期使用甾体抗炎药物毒副作用大的问题,有可能为Ⅲ型前列腺炎的治疗提供一种新的策略。