猪轮状病毒(Porcine Rotaviruses,PoRV)是仔猪病毒性腹泻的主要病原体之一,主要引起幼龄仔猪呕吐、腹泻和厌食。该病流行范围广,发病率高,给畜牧业造成严重的经济损失。为了解豫西南地区Po RV遗传变异情况和流行特点,本研究采用RT-PCR方法对近年来豫西南地区各生猪养殖场送检的临床组织和粪便样品进行病原学检测,明确其流行趋势与发生规律。进一步扩增Po RV vp6基因片段,了解Po RV毒株变异信息,进一步在MA-104细胞中对于检测毒株进行分离培养,分离轮状病毒株。随后构建了Po RV VP6的原核表达载体,表达纯化蛋白,免疫BALB/c小鼠,筛选出能够有效结合VP6的单克隆抗体,具有较高的应用价值。本研究有利于深入理解Po RV的变异与流行algae microbiome,为后期建立灵敏度高、快速简单的Po RV检测方法提供了生物学材料。结论如www.selleck.cn/products/ve-822下:1.采用RT-PCR方法对2020～2022年豫西南地区送检的腹泻病料进行流行病学调查以及病原学检测。结果显示230份送检腹泻病料中检测出54份阳性,总阳性率23.48%,2021年发病率最高为31.36%(37/118)。在不同季度的Po RV发病率调查发现在第四季度(10～12月)阳性率最高,为31.25%(15/48)。猪轮状病毒主要在10-12月,寒冷气候下多发。2.阳性样品进行RT-PCR检测,并进行基因测序,将vp6基因序列进行遗传进化分析,发现所扩增毒株vp6主要为I5型。序列比对分析发现5株与FX17株相近,4株与HB-KS96株相近,1株和FNCY株相近。10株分离株的核苷酸相似性在87.8%～99.6%,氨基酸相似性为92.1%～99.4%,差异较小。与所收集的Gene Bank数据库中的近几年发表的6株毒株相比,核苷酸相似性为84.2%～99.7%,氨基酸相似性为91.2%～99.7%。将检测阳性样品处理后接种到MA104细胞中,发现未接毒细胞在铺板培养48h后有少量死细胞,大量细胞还贴壁生长,接毒48h后的细胞聚集拉网,贴壁减少,盲传六代均有细胞病变,成功分离到一株猪轮状病毒,将其命名为He NNY202001。利用MEGA 11软件将He NNY202001分离株扩增的VP6氨基酸序列与近几年流行的毒株序列进行比对,相似性为88.4%～98.3%。与牛源RV相似性为90.6%,与人源RV相购买MK-2206似性为94.3%,与猪源相似度最高,为97.1%。3.进一步将所分离的轮状病毒HeNNY202001毒株1194 bp的vp6基因进行原核表达载体的构建,构建了重组表达菌p ET28a-Msy B-Po RV-VP6,IPTG诱导后在70 k Da处有蛋白条带。随后对于VP6重组蛋白进行纯化,发现VP6蛋白为可溶性蛋白。Western blot结果显示:带有his标签的重组猪轮状病毒VP6蛋白能够与6*His抗体发生特异性反应。用重组蛋白免疫6～8周龄的BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠抗体水平,随着免疫次数增多,小鼠抗体水平也在上升。加强免疫后,分析单只小鼠抗体效价,效价最高的进行脾细胞的分离及杂交瘤细胞的制备。亚克隆三次后,最终筛选出5株阳性杂交瘤细胞株。大量扩繁阳性杂交瘤细胞株,进行小鼠腹腔注射,收集腹水并纯化。SDS-PAGE电泳显示所纯化的抗体有两条条带,分别为55 k Da处重链和25 k Da处轻链。用分离的Po RV进行Western blot检测,经鉴定2G9-11、4G1-8和4G2-8单抗可以特异性识别分离株HeNNY202001。