木质纤维素来源广泛、数量巨大,是一种自然界丰富的可再生资源,对其开发利用在节能减排、环境保护、优化能源结构和社会可持续发展等方面具有重要意义。但needle prostatic biopsy是由于纤维素的高度结晶组织、木质素的复杂结构以及半纤维素的高度多样性和异质性造成其难以被降解,从而限制了其开发利用。而在自然界中存在许多可以降解利用木质纤维素的微生物,主要包括产游离酶系的好氧真菌如里氏木霉(Trichoderma reesei),和复合体酶系的厌氧细菌如解纤维素梭菌(Ruminiclostridium cellulolyticum)。解纤维素梭菌(R.cellulolyticum)是一种厌氧嗜中温梭菌,它能够分泌多种纤维素酶的复合体-纤维小体(cellulosome)来高效降解木质纤维素,其中无催化活性的骨架蛋白的(Scafoldin)的黏附域能够与酶组分的锚定域特异性的相互作用。在R.cellulolyticum,其纤维小体cip-cel基因簇中有12个编码纤维素降解所必需的纤维素酶基因和骨架蛋白基因。我们前期转录组数据发现,cip-cel基因簇为一个转录单位,即操纵子(operon)。同时还发现该基因簇的5′UTR转录一个游离的s RNA(small RNA),该s RNA和下游纤维小体基因在不同的碳源下转录丰度发生显著差异。为此,该5′UTR发PLX4032 IC50挥什么样的作用来调控下游纤维小体基因的表达?本研究以R.cellulolyticum为主要研究对象,分析了纤维小体编码基因簇cip-cel中5′UTR的功能。首先,对纤维小体编码基因簇cip-cel 5′UTR与下游基因的表达进行分析,发现5′UTR与下游基因在不同碳源下的表达具有显著差异。通过q PCR与Northern blot实验分析发现fbfp转录本在https://www.selleck.cn/products/kpt-330.html木糖下转录水平最高,纤维二糖次之,葡萄糖下最低。同时,利用Gus A报告系统在纤维二糖、葡萄糖、木糖及纤维素下对Pcip-UTR和Pcip的启动子活性进行比较,发现Pcip-UTR启动子活性在葡萄糖下表达量低,而在纤维素下表达量较高。此外,通过等温滴定微量热法(ITC)检测了糖信号分子与5′UTR的相互作用,发现葡萄糖与5′UTR具有亲和力,K_a值能达到10~6,而纤维二糖与5′UTR没有相互作用。因此,推测cip-cel基因簇的5′UTR潜在具有核糖开关的功能来调控下游纤维小体基因的表达。其次,在转录组数据的基础上,对纤维小体cip-cel基因簇5′UTR的剪切发生进行了鉴定。将5′UTR克隆到Fb FPs荧光蛋白报告系统中,通过PCR扩增以及Northern blot实验鉴定了5′UTR剪切事件的发生。然后通过利福平稳定性实验分析并计算了fbfp转录本的半衰期,结果表明5′UTR的剪切能显著提高下游基因转录本的稳定性。除此之外,我们通过自剪切验证了5′UTR不具有glm S核酶的功能,游离的s RNA的产生是由于细菌细胞内核糖核酸酶作用的结果。再次,纤维小体cip-cel基因簇5′UTR的结构功能分析。在确认s RNA由5′UTR剪切产生的基础上,利用Mfold二级结构预测软件对cip-cel基因簇5’UTR的结构进行了解析。根据转录方向将5′UTR分为五部分,依次命名为R1,R2,R3,CS和R4。为了进一步解析该结构,我们构建了不同的突变体,并将其克隆到双荧光蛋白报告系统中。Northern blot结果表明在R3和R4中分别存在一个RNA剪切加工位点,并且发现R3和R4中的剪切位点均位于茎环的上游。除此之外,在R3中还发现存在一个转录终止子,信号分子通过与5′UTR的结合引起其结构的变化,激活5′UTR的转录终止活性进而控制下游基因转录提前终止。最后,开发了一种荧光染料Cy5.5标记DNA探针的核酸印记杂交方法。以R.cellolyticum为研究对象,通过Southern blot和Northern blot方法检测了Cy5.5标记DNA探针的特异性和敏感性。通过Cy5.5标记的DNA探针,我们成功通过Southern blot鉴定了基因的插入失活,并通过Northern blot分析了基因的差异表达和RNA的剪切加工。使用Cy5.5标记DNA探针避免了使用危险的放射性同位素标记试剂,并且杂交信号可以通过荧光成像系统直接检测,特异性和灵敏度更强。在研究生物成像和生物分子间相互作用等方面具有良好的应用前景。总之,通过以上的研究,我们初步对5′UTR的结构和功能进行了分析。发现5′UTR在不同碳源下影响下游基因的转录水平。位于纤维小体cip-cel基因簇的5′UTR潜在具有核糖开关的功能,通过感受细胞内糖分子信号进而调控下游纤维小体基因的表达,当细胞内存在葡萄糖时,5′UTR与其结合后结构发生改变,进而终止下游基因的转录。因此,纤维小体编码基因的5′UTR在其表达调控方面潜在扮演重要角色。本研究不仅进一步丰富核糖开关和5′UTR的分子识别和纤维小体的表达调控机制,而且为进一步理解RNA作为新的调控手段在细菌生命活动中发挥的作用等方面具有重要意义。