目的:CidA-LrgAB系统与细菌程序性死亡、细菌裂解和丙酮酸代谢等生物学功能密切相关,但在葡萄球菌中的功能尚不清楚。本研究通过构建表皮葡萄球菌SE1457 lrgAB基因敲除突变株研究其生物学表型与相关基因的表达情况,初步探索LrgAB在表皮葡萄球菌细胞代谢、生物膜形成和压力胁迫应激等生物学功能中的作用,为防治表皮葡萄球菌引起的持续性感染奠定基础。方法:1.表皮葡萄球菌SE1457 LrgAB同源性分析及SE1457 lrgAB基因敲除突变株的构建:以表皮葡萄球菌SE1457基因组DNA为模板,重叠PCR扩增lrgAB基因的上/下游约2.0kb的同源臂片段(att B1-DS-US-att B2),与穿梭质粒p KOR1(含attp位点与cdd B位点)连接后经BP反应构建p KOR1-ΔlrgAB重组质粒,转化至大肠杆菌DC10B修饰后再电击转入SE1457,经Atc诱导筛选获得疑似ΔlrgAB突变株;同样以表皮葡萄球菌SE1457基因组DNA为模板PCR扩增获得lrgAB基因(含SD序列),并经T_4连接酶与质粒p CN51连接获得p CN51-lrgAB重组质粒,分别电击转入ΔlrgAB突变株和SE1457野生株,通过PCR、RT-PCR、q RT-PCR及测序验证ΔlrgAB突变株、ΔlrgAB(p CN51-lrgAB)互补株、ΔlrgAB(p CN51)空载株和SE1457(p CN51-lrgAB)对照株。2.表皮葡萄球菌ΔlrgAB突变株生物学表型研究:试管稀释法检测表皮葡萄球菌SE1457及其ΔlrgAB突变株的药物敏感性;微量平板半定量法检测表皮葡萄球菌的生物膜形成情况,q RT-PCR检测生物膜内e DNA含量;通过1%Triton X-100诱导菌株自溶,透射电镜观察细胞壁显微结构;检测表皮葡萄球菌在应对渗透压(0.5M、1.0M、1.5M Na Cl)、酸(p H6.0、p H5.0、p H4.0 HCl)和过氧化氢(0.25m Adezmapimod分子量M、0.5m M、0.75m M H_2O_2)等压力胁迫因子的耐受力;检测表皮葡萄球菌SDH(琥珀酸脱氢酶)和NOX(NADH氧化酶)的活性。3.转录组测序(RNA-Seq):抽提表皮葡萄球菌SE1457及ΔlrgAB突变株RNA,采用Illumina测序技术对ΔlrgAB突变株和SE1457进行转录组测序,筛选出SE1457及ΔlrgAB突变株差异表达基因,并对差异表达基因进行GO、KEGG等生物信息学分析,分析表皮葡萄球菌LrgAB生物学功能。结果:1.表皮葡萄球菌SE1457 LrgAB同源性分析:SE1457 lrg A/lrg B基因座位为serp2026/serp2027,由459nt lrg A/702nt lrg B核苷酸组成,编码产生152aa Lrg A/233aa Lrg B氨基酸组成的蛋白质。SE1457 lrg A/lrg B与表皮葡萄球菌RP62A和SE12228类似物核苷酸序列的同源性分别约为98%和97%,与金黄色葡萄球菌的同源性为62%-73%,与变异链球菌的同源性为47.5%-55.5%。SE1457Lrg A/Lrg B与表皮葡萄球菌RP62A和SE12228类似物氨基酸序列的同源性分别约为99%和97%,与金黄色葡萄球菌的同源性为54%-72%,与变异链球菌的同源性为29%-47%。2.表皮葡萄球菌SE1457 lrgAB基因突变株及互补株的构建及鉴定:重叠PCR扩增获得表皮葡萄球菌SE1457 lrgAB基因的上/下游同源臂片段(att B1-DS-US-att B2)(2050bp),与质粒p KOR1进行BP反应成功构建p KOR1-ΔlrgAB重组质粒,转入SE1457后经Atc诱导筛选获得疑似ΔlrgAB突变株。PCR显示ΔlrgAB突变株中未扩增出lrgAB片段,测序结果提示大小为1164bp的lrgAB基因从SE1457基因组中敲除;q RT-PCR结果显示,ΔlrgAB突变株中lrg A/lrg B基因未见转录,与SE1457野生株相比,ΔlrgAB(p CN51-lrgAB)互补株及SE1457(p CN51-lrgAB)对照株中lrg A基因转录水平均约为1.8倍,而lrg B基因转录水平分别约为0.2倍和1.3倍。3.表皮葡萄球菌ΔlrgAB突变株生物学表型检测结果:(1)试管稀释法结果显示,与SE1457相比,ΔlrgAB突变株对作用于细胞壁的抗生素(万古霉素、氨苄青霉素、杆菌肽)和作用于蛋白质的抗生素(氯霉素、庆大霉素)的药物敏感性均升高,而ΔlrgAB(p CN51-lrgAB)互补株和SE1457(p CN51-lrgAB)对照株的药物敏感性基本回复至野生株SE1457水平,但ΔlrgAB突变株对环丙沙星和青霉素的药物敏感性与SE1457无显著差异性。(2)微量平板半定量法检测表皮葡萄球菌生物膜形成结果显示:野生株SE1457在6h、12h、24h和48h生物膜形成量(OD_(570))分别为0.749±0.05、0.951±0.03、1.959±0.02和2.631±0.05。与野生株SE1457相比,ΔlrgAB突变株生物膜形成能力(上述4个时间点分别为0.483±0.01、0.347±0.01、0.286±0.01和0.950±0.02)显著降低(P<0.01);ΔlrgAB(p CN51-lrgAB)互补株的生物膜可回复至野生株SE1457水平;SE1457(p CN51-lrgAB)对照株生物膜形成量高于SE1457;ΔlrgAB(p CN51)空载株在各时间段生物膜形成量分别为0.510±0.02、0.332±0.01、0.242±0.02和0.573±0.01,ΔlrgAB生物膜形成量是SE1457野生株的30%-40%。(3)qRT-PCR定量检测表皮葡萄球菌生物膜基质中e DNA(以gyr B、lys A、serp0306、leu A基因为代表),结果显示ΔlrgAB突变株生物膜中e DNA含量显著高于SE1457(P<0.01);ΔlrgAB(p CN51-lrgAB)互补株生物膜中e DNA含量回复至野生株SE1457水平,而SE1457(p CN51-lrgAB)对照株生物膜中e DNA含量低于SE1457。(4)Triton X-100诱导的自溶结果显示,ΔlrgAB突变株及ΔlrgAB(p CN51)空载株在振荡培养6h后其自溶率约为70%,同样时间野生株SE1457、ΔlrgAB(p CN51-lrgAB)互补株及SE1457(p CN51-lrgAB)对照株的自溶率分别约为37%、44%和22%,Δatl E(阴性对照株)自溶率约16%,ΔlrgAB突变株较野生株SE1457的自溶能力显著增强。(5)透射电镜结果观察:SE1457细胞壁光滑、完整,细胞壁及细胞膜清晰;ΔlrgAB突变株较SE1457细胞壁表面粗糙,出现了间断现象。(6)表皮葡萄球菌压力胁迫因子耐受情况:与SE1457野生株相比,ΔlrgAB突变株对渗透压(0.5M、1.0M、1.5M Na Cl)、酸(p H6.0、p H5.0、p H4.0)和H_2O_2(0.25m M、0.5m M、0.75mBelumosudil价格 M)压力胁迫因子的耐受性显著增强(约10倍),ΔlrgStudents medicalAB(p CN51)空载株耐受性与ΔlrgAB突变株相近,当lrgAB基因回复至ΔlrgAB突变株后耐受性降低至SE1457野生株水平,SE1457(p CN51-lrgAB)对照株与野生株SE1457相似。胁迫因子作用下表皮葡萄球菌生长曲线(OD_(600))检测结果与上述结果一致,显示ΔlrgAB突变株在上述压力下耐受性较SE1457野生株增强。(7)表皮葡萄球菌SDH与NOX活性检测,结果显示ΔlrgAB突变株SDH和NOX活性(16.08±4.66和433.91±114.84 U/mg prot)较野生株SE1457(34.03±6.49和795.53±115.83 U/mg prot)显著降低,而ΔlrgAB(p CN51-lrgAB)互补株双酶活性与野生株SE1457水平相似。(8)转录组测序及q RT-PCR分析结果发现385个差异表达基因,上调基因299个,下调基因86个,主要集中于自溶、糖代谢、氧化磷酸化、蛋白质代谢等途径。自溶调节相关基因中维持膜完整性相关基因(serp0849、serp2187等)下调,而磷壁酸D-丙氨酸酯化相关基因(dlt A/C/D)、胞壁质水解酶合成相关基因(serp2120、serp0422、serp2136等)和青霉素结合相关蛋白(serp1412、serp0227等)均上调;氧化磷酸化中丙酮酸合成相关基因(pfl A、pfl B、fpg、nrd F1等)下调;质子泵ABC超家族转运蛋白差异表达基因(serp2003、serp2004、serp2005、serp0021、serp2017、sit A/sit B等)和压力调节基因(dlt C/dlt D等)上调,而糖代谢相关基因(gnt K、gnt P、pyc等)、氨基酸合成基因(sdh B、dat等)和耐药调节基因(serp2380、serp0844等)均下调。ΔlrgAB突变株测序差异表达基因中未发现cid A基因出现显著变化,但q RT-PCR结果显示cid A基因下调约10倍。未发现ica R和ica A基因转录水平改变。结论:1.成功敲除lrgAB基因,获得表皮葡萄球菌SE1457ΔlrgAB突变株,并成功构建ΔlrgAB(p CN51-lrgAB)互补株、SE1457(p CN51-lrgAB)对照株及ΔlrgAB(p CN51)空载株;2.表皮葡萄球菌LrgAB正调节CidA的转录,与细菌的多种生物学功能相关;3.LrgAB通过参与调控磷壁酸D-丙氨酸酯化与胞壁质水解酶活性影响表皮葡萄球菌的自溶;4.LrgAB通过非ica途径间接调控表皮葡萄球菌生物膜的形成;5.LrgAB可能参与丙酮酸利用、质子泵作用,以及糖、蛋白质和核酸代谢等多条途径影响表皮葡萄球菌的药物敏感性和对环境胁迫因子的耐受性。