目的:主动脉夹层(Aortic Dissection,AD)是致命性心血管疾病,目前其临床预测标志物较少且致病分子机制研究不明。本研究主要目的包括(1)筛选AD患者血清中差异表达的外泌体mi RNAs及其靶基因参与的信号通路。(2)评估差异表达的外泌体mi RNAs和蛋白对主动脉夹层的诊断效能。(3)研究AD血清外泌体对主动脉夹层的致病作用。(4)探讨AD血清外泌体中目标mi RNA引起内皮细胞损伤促进AD发生发展的作用靶点及分子机制。方法:第一部分:收集AD患者和健康体检者血清进行外泌体分离纯化鉴定后,进行外泌体mi RNAs测序分析。使用DEGseq对差异表达的mi RNAs进行分析,Target Scan对外泌体差异表达的mi RNAs靶基因预测,DAVID分析靶基因参与的GO富集过程和KEGG信号通路。第二部分:通过对第一部分差异表达的外泌体mi RNAs进行筛选,挑选差异表达倍数高、与AD发病相关的外泌体mi RNAs进一步使用RT-PCR扩大验证。与AD发病相关的蛋白(MMP-9/12等)进行ELISA检测。统计学分析后绘制ROC曲线评估mi RNA和蛋白的诊断价值。并用spearman分析标志物之间的相关性,在此基础上,选择mi RNA和蛋白作为联合诊断的潜在生物标志物,评估联合诊断效能。第三部分:提取主动脉夹层患者和健康人群的血清外泌体并通过蛋白质免疫印迹、浓度粒径分析和透射电子显微镜进行表征。用PKH26标记外泌体,荧光倒置显微镜观察内皮细胞对外泌体摄取作用。使用氨基丙腈和Ang-II构建主动脉夹层体内外损伤模型,通多蛋白质免疫印迹反应、TUNEL、CCK-8、划痕实验和成管实验研究外泌体对内皮细胞凋亡、增殖、迁移和成管的影响。第四部分:AD患者外泌体可以促进内皮细胞损伤,前期测序结果发现主动脉夹层患者血清外泌体mi RNA与健康人群表达存EMB endomyocardial biopsy在差异,由此我们推断AD外泌体致病作用是通过外泌体中的mi RNA导致的。根据第一部分及第二部分结果,选择差异表达倍数较高、诊断效能好、与AD发病相关的mi R-202-3p作为研究重点,通过RT-PCR验证外泌体包裹释放mi RNA。过表达mi R-202-3p,通过流式凋亡检测试剂盒、CCK-8、划痕实验和成管实验研究其对内皮细胞凋亡、增殖、迁移和成管的影响。使用Target selleck抑制剂Scan数据库预测mi R-202-3p靶基因,并用双荧光素酶基因报告进行验证。抑制mi R-202-3p和靶基因表达,通多蛋白质免疫印迹和RT-PCR研究mi RNA-202-3p对靶基因及信号通路的调控。结果:第一部分:当P<0.05和|log2foldchange(FC)|>0.5时,筛选出差异表达的外泌体mi RNAs有231个,表达量上调的有130个,表达量下调的有101个。生物信息学富集分析发现,差异表达的外泌体mi RNAs靶基因主要集中在细胞粘附、蛋白质乙酰化、细胞生物合成等过程。参与Ras信号通路、细胞外基质粘附和上皮细胞信号传导等信号通路。第二部分:RT-PCR对筛选的8个外泌体mi RNAs进一步扩大验证,发现主动脉夹层患者血清外泌体中mi R-499a-5p、mi R-543、mi R-206、mi R-4433b-3p、mi R-744-5p、mi R-4488、mi R-202-3p的表达量明显上调(P<0.05),这些mi RNAs表达趋势与测序结果一致。此外,还发现与AD发病相关的蛋白MMP-9、MMP-12、TGF-β和D-二聚体表达水平变化。进一步评估了差异表达外泌体mi RNAs和蛋白的诊断效能,诊断灵敏度最高为mi R-744-5p(93.3%,AUC=0.831),诊断特异性最高为mi R-4433b-3p(86.7%,AUC=0.861)。并且发现mi R-499a-5p、mi R-4433b-3p和mi R-206灵敏度和特异度均在80%以上。在相关性分析的基础上,mi RNAs和蛋白作为联合诊断的潜在生物标志物,联合诊断中灵敏度最高的组合为mi R-202-3p+TGF-β(96.7%,AUC=0.844),特异度最高的组合为mi R-499a-5p+mi R-4433b-3p(85%,AUC=0.840)。对诊断效能较高的mi RNA进行靶基因功能富集,结果显示其靶基因可能参与调控淀粉样蛋白-β代谢过程、T细胞迁移、Fox O、突触囊泡循环和PI3K-Akt等信号传导途径。第三部分:对两组患者血清外泌体表达量进行分析发现,AD患者血清中外泌体表达量增多,并且外泌体可以被内皮细胞摄取、内化进而在细胞间发挥作用。将AD患者(AD-Exo)和健康人群(Con-Exo)的血清外泌体转染进内皮细胞,结果发现,AD-Exo明显促进内皮细胞凋亡、抑制内皮细胞增殖、迁移和血管生成(P<0.05),而抑制外泌体后,AD-Exo对内皮细胞损伤程度减轻(P<0.05)。第四部分:外泌体mi R-202-3p在主动脉夹层模型小鼠和AD患者血清中表达升高,外泌体作为载体,可以包裹释放mi R-202-3p。内皮细胞中过表达mi R-202-3p后,与AD-Exo的损伤结果一致,内皮细胞凋亡程度增加,增殖、迁移和血管生成降低(P<0.05)。通过Target Scan预测和双荧光素酶基因报告实验确认PI3KCA是mi R-202-3p下游靶基因,且受到mi R-202-3p的负向调控。在外源性干预mi R-202-3p条件下联合PI3K抑制剂,内皮细胞凋亡、增殖、迁移和血管生成能力得到部分恢复。Compound C抑制剂AD患者和小鼠AD模型的主动脉中,PI3K/AKT/Fox O1信号通路激活,基因表达水平出现轴向变化。过表达mi R-202-3p后,蛋白质印迹反应和RT-PCR检测PI3KCA、p-AKT和p-Fox O1表达水平出现轴向变化,PI3KCA、p-AKT表达水平降低,p-Fox O1表达水平升高。结论:(1)在AD患者血清中,通过高通量测序技术筛选出231个差异表达的外泌体mi RNAs。其靶基因主要集中在蛋白质乙酰化、细胞生物合成等过程,主要参与Ras信号通路、细胞外基质粘附、上皮细胞信号传导等信号通路。(2)mi R-499a-5p、mi R-202-3p等在主动脉夹层患者血清外泌体中表达水平升高,并且对主动脉夹层具有较高的诊断效能。相比单一指标,mi R-499a-5p+mi R-4433b-3p组合联合诊断效能较优。(3)主动脉夹层患者血清中外泌体蛋白含量升高,可以被内皮细胞摄取、内化,进而影响内皮细胞凋亡、成管、迁移和增殖等过程,表明AD-Exo介导内皮细胞损伤参与主动脉夹层发病过程。(4)AD患者血清中差异表达的外泌体mi R-202-3p通过靶基因PI3K负向调控PI3K/AKT/Fox O1信号通路发挥其内皮细胞损伤作用,促进主动脉夹层发生发展。