线粒体呼吸链复合物III抑制剂在国际上被广泛用于植物真菌和卵菌病害防治,国际杀SARS-CoV-2 infection菌剂抗性行动委员会(Fungicide Resistance Action Committee,FRAC)根据药剂在复合物III上结合位点的差异,将该类杀菌剂划分为QoI、QiI和QoSI三类。唑嘧菌胺是由巴斯夫公司研发的具有全新化学结构的QoSI类杀菌剂,氰霜唑、吲唑磺菌胺和Y14079是近年来开发的QiI类杀菌剂。目前植物病原菌对呼吸链复合物III抑制剂的抗性研究主要集中在QoI杀菌剂上,而病原菌对唑嘧菌胺、氰霜唑、吲唑磺菌胺和Y14079等QoSI和QiI杀菌剂的抗性风险和抗性分子机制却鲜有报道。本研究以荔枝霜疫霉为靶标菌,研究了其对唑嘧菌胺、氰霜唑、吲唑磺菌胺和Y14079的抗性风险及抗性分子机制,取得研究结PUN30119核磁果如下:(1)测定了唑嘧菌胺、氰霜唑、吲唑磺菌胺和Y14079对植物病原真菌和卵菌的抑菌活性。杀菌剂抑菌谱范围由大到小依次为氰霜唑、吲唑磺菌胺、Y14079和唑嘧菌胺;4种杀菌剂对荔枝霜疫霉、大豆疫霉、致病疫霉、瓜果腐霉、宽雄腐霉、寡雄腐霉和贵阳腐霉均表现出良好的菌丝生长抑制活性,且对荔枝霜疫霉的抑制活性最为显著(0.00090-0.18μg/m L)。进一步测定了唑嘧菌胺、氰霜唑、吲唑磺菌胺和Y14079对荔枝霜疫霉不同发育阶段的影响。结果表明,4种杀菌剂对荔枝霜疫霉的菌丝生长(0.0087-0.20μg/m L)、孢子囊萌发(0.0026-0.19μg/m L)和休止孢萌发(0.0016-0.0099μg/m L)均表现出优异的抑制作用。(2)采用菌丝生长速率法分别测定了来自广西、广东、福建和海南等省份的荔枝霜疫霉对唑嘧菌胺、吲唑磺菌胺、氰霜唑和Y14079的敏感性,4种杀菌剂对荔枝霜疫霉的平均EC_(50)分别为0.17±0.09μg/m L、0.24±0.11μg/m L、0.0091±0.0028μg/m L和0.21±0.10μg/m L。荔枝霜疫霉对4种杀菌剂的敏感性频率分布均呈连续单峰曲线,表明田间不存在对唑嘧菌胺、吲唑磺菌胺、氰霜唑和Y14079敏感性下降的抗性亚群体,其平均EC_(50)可分别作为荔枝霜疫霉对4种杀菌剂的敏感基线,为将来荔枝霜疫霉对唑嘧菌胺、吲唑磺菌胺、氰霜唑和Y14079的田间抗性监测提供参考。(3)通过室内药剂驯化法分别获得了对唑嘧菌胺、吲唑磺菌胺、氰霜唑和Y14079表现高水平抗性的荔枝霜疫霉抗性突变体,4种杀菌剂的平均抗性突变频率分别为1.62×10~(-2)、3.91×10~(-3)、2.24×10~(-3)和4.75×10~(-3),且杀菌剂抗性均可在荔枝霜疫霉中稳定遗传。荔枝霜Mirdametinib疫霉抗性突变体及其亲本菌株的生存适合度结果显示,唑嘧菌胺抗性突变体的生存适合度与亲本菌株相当或显著低于亲本菌株,吲唑磺菌胺、氰霜唑和Y1407抗性突变体的生存适合度均显著低于其亲本菌株。4种杀菌剂与甲霜灵、烯酰吗啉和氟噻唑吡乙酮之间不存在交互抗性,唑嘧菌胺与嘧菌酯和吲唑磺菌胺存在不同程度的负交互抗性,吲唑磺菌胺、氰霜唑和Y14079互相之间存在正交互抗性。综合室内获得抗性突变体的难易程度,抗性突变体的生存适合度和交互抗性,并结合“病原菌—药剂”组合的固有抗性风险等级的理论分析结果,推测荔枝霜疫霉对唑嘧菌胺具有中到高等抗性风险,荔枝霜疫霉对吲唑磺菌胺、氰霜唑和Y14079具有中等抗性风险。(4)克隆并比对了荔枝霜疫霉抗性突变体和亲本菌株的细胞色素b蛋白编码基因Pl Cytb,结果显示,唑嘧菌胺抗性突变体中存在C98T和G682A单位点突变,导致Pl Cytb上产生S33L和D228N氨基酸替换;吲唑磺菌胺抗性突变体中存在C43T单位点突变和G89A+T658C连锁突变,导致Pl Cytb上产生H15Y和G30E+F220L的氨基酸替换;氰霜唑和Y14079抗性突变体中存在T660G的单位点突变,导致Pl Cytb上产生F220L氨基酸替换。荔枝霜疫霉Pl Cytb基因表达量测定结果显示,抗性突变体和亲本菌株的靶基因接触到杀菌剂后未发生过量表达。线粒体细胞色素bc1复合物活性测定结果表明,药剂对抗性突变体的细胞色素bc1复合物活性无显著抑制活性,主要通过Pl Cytb上氨基酸替换来干扰药剂与靶蛋白的互作而表现出抗性。药剂分子与Pl Cytb蛋白的分子对接结果表明,Pl Cytb上氨基酸替换可引起药剂结合腔的构象发生改变,导致药剂分子与靶蛋白之间参与互作的氨基酸数目减少,结合能降低。大豆疫霉过表达转化验证试验表明,Ps Cytb上S33L和D228N氨基酸替换是导致大豆疫霉对唑嘧菌胺产生抗性的原因。综上所述,荔枝霜疫霉Pl Cytb上S33L和D228N氨基酸替换与荔枝霜疫霉对唑嘧菌胺的抗性相关,H15Y、G30E+F220L氨基酸替换与荔枝霜疫霉对吲唑磺菌胺的抗性相关,F220L氨基酸替换与荔枝霜疫霉对氰霜唑和Y14079的抗性相关,其中S33L为QoSI类杀菌剂的主要抗性类型,F220L为QiI类杀菌剂的主要抗性类型。(5)综合荔枝霜疫霉抗性突变体生存适合度和药剂交互抗性结果,表明荔枝霜疫霉Pl Cytb上S33L和F220L氨基酸替换突变体在田间具有较大的潜在抗性风险。本研究针对荔枝霜疫霉Pl Cytb上S33L和F220L氨基酸替换建立了AS-PCR快速检测方法,可用于区分携带相关位点突变的抗性和敏感菌株。综上所述,荔枝霜疫霉对唑嘧菌胺具有中到高等抗性风险,对氰霜唑、吲唑磺菌胺和Y14079具有中等抗性风险。荔枝霜疫霉对QoSI和QiI类杀菌剂的抗性是由Pl Cytb基因上点突变引起的,其中S33L氨基酸替换是荔枝霜疫霉对唑嘧菌胺产生抗性的主要类型,F220L氨基酸替换为荔枝霜疫霉对氰霜唑、吲唑磺菌胺和Y14079产生抗性的主要类型,并针对Pl Cytb上S33L和F220L氨基酸替换建立了AS-PCR快速分子检测方法。本研究加深了人们对QoSI和QiI类杀菌剂的认识,为该类杀菌剂的科学使用、杀菌剂反抗性设计、田间抗性群体早期预警与监测以及荔枝霜疫霉病的综合治理提供理论依据和技术支持。