固醇是昆虫生长发育和繁殖所必需的营养物质,但是昆虫本身并不能够合成固醇而只能通过食物获得。体内固醇水平失衡会影响昆虫的生长发育,对昆虫造成不利影响。所有真核细胞都必须将胆固醇浓度维持在一定的范围内才能行使正常的功能,昆虫通过调控固醇吸收、外排、酯化等方式来维持体内固醇平衡。研究表明核激素受体HR96在调节胆固醇营Biotic surfaces养中起到不可或缺的作用,它通过调控胆固醇摄取、代谢和运输相关基因表达从而将体内固醇维持在一定范围内。本研究以重要入侵害虫草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(Smith)为研究对象,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除草地贪夜蛾HR96基因,分析其在草地贪夜蛾固醇稳态中的功能。主要研究结果如下:1、基于6种胆固醇浓度饲料饲喂生长发育指标,确定饲料中胆固醇浓度1mg/g为满足草地贪夜蛾正常完成整个生命周期的最低适宜浓度。饲料中不添加胆固醇,仅有个别幼虫发育到二龄,95%以上个体一周内死亡。胆固醇浓度增加到1 mg/g时化蛹率、羽化率和卵孵化率高达90%以上,同时产卵量、成虫寿命也接近正常水平,且胆固醇浓度继续增加后各项指标没有显著差异,因此根据草地贪夜蛾6种浓度胆固醇幼虫发育历期、蛹期和成虫繁殖特征等各项指标,最后确定饲料中胆固醇浓度1 mg/g为满足草地贪夜蛾正常完成整个生命周期的最低适宜浓度。2、利用GC-MS法测定草地贪夜蛾主要寄主植物固醇种类及含量,为实验室开发草地贪夜蛾人工饲料提供理论依据。采用气相色谱质谱联用仪,对植物中的胆固醇、豆固醇、菜油固醇、谷固醇等固醇含量进行了测定,结果显示小麦和玉米中主要以谷固醇为主,嫩叶中谷固醇含量分别为16.15μg/mg和16.36μg/mg,含量分别占总固醇的60.69%和64.74%,然而胆固醇含量较少,含量分别为2.85μg/mg和1.19μg/mg,仅为总固醇的10.71%和4.71%;寄主植物不同部位总含量表明,小麦嫩叶、老叶和茎中总固醇含量分别为26.61μg/mg、35.25μg/mg和36.99μg/mg,统计分析没有显著差异,表明固醇广泛存在于植物各个部位且没有组织特异性。通过检测寄主植物总固醇含量为实验室用人工饲料饲养实验种群提供一定的理论基础。3、通过建立目的基因进化树和荧光定量PCR技术,分析目的基因进化关系和表达特性。利用13个物种目的基因蛋白序列系统发育分析确定不同物种的HR96基因的进化关系。HR96高度保守,来源于同一个祖先并随着物种的分化而分化。通过qPCR定量确定目的基因表达模式。HR96在幼虫中低水平表达,在卵和成虫中表达量高于幼虫。组织中中肠和马氏管中特异性高表达,是脂肪体4至6倍。这与其参与调控固醇平衡MS-275使用方法、代谢和转运相关基因表达功能有关。4、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术验证目的基因功能,揭示目的基因HR96在草地贪夜蛾胆固醇稳态中的分子机制,确定与固醇吸收代谢相关基因之间的作用。基于CRISPR/Cas9技术敲除目的基因并获得稳定遗传的突变纯合品系。通过饲喂4种浓度胆固醇饲料发现在0.5 mg/g和2 mg/g的胆固醇浓度下80%以上HR96敲除纯合品系在饲养的12天内死亡,然而90%以上的对照正常生长。通过GC-MS检测发现10 mg/g和20 mg/g高胆固醇饲料上虫体内胆固醇积累高于正常水平。荧光定量分析结果表明在低胆固醇饲料中野生型NPC1b表达量上调,而HR96基因敲除纯合品系中,无论饲料中胆固醇含量升高或者降低,NPC1b基因高表达且没有显著差异,表明该基因丧失了对胆固醇的感知能力,这也可能是突变体中胆固醇严重积累原因。前期课题组研究发现棉铃虫Ha OG200342负责特异性地排出胆甾烷醇,本研究发现草地贪夜蛾的直系同源基因XP-050561670.1不受胆固醇诱导,无论何种浓度饲料饲喂都似乎低表达,因此我们猜测XP-05Cobimetinib生产商0561670.1可能也是特异排出胆甾烷醇,后续需要通过饲喂胆甾烷醇饲料测定HR96敲除纯合品系体内固醇含量和XP-050561670.1定量表达量来进一步研究确定。综上所述,本研究从昆虫固醇吸收代谢角度出发,探究草地贪夜蛾体内固醇平衡的分子机制及关键基因。初步分析了HR96在入侵害虫草地贪夜蛾体内固醇平衡中的作用,揭示了草地贪夜蛾固醇稳态途径重要基因的功能原理。这些研究为完善昆虫的固醇代谢理论提供了重要信息。