【研究背景及目的】阿尔茨海默病(AD)是一种以淀粉样斑块和tau缠结为特征的难治性神经退行性疾病,其主要症状是记忆丧失和进行性神经认知功能障碍。AD的主要病理特征是老年斑和神经纤维缠结(NFT),分别由细胞外的β-淀粉样蛋白(Aβ)和神经元内过度磷酸化的tau组成。然而,迄今为止,很多针对Aβ相关病理的“有前途”候选药物都在临床试验中失败。因此,可能是时候考虑AD治疗的其他替代靶点了。tau蛋白是一种重要的微管相关蛋白,充当神经元微管的稳定剂。当tau过度磷酸化时,它从微管迁移并触发tau聚集的自我增殖级联反应,导致毒性NFT产生、神经元细胞死亡,最终导致AD。由于tau蛋白是AD的关键驱动因素以及潜在靶点,因此靶向清除tau蛋白可能是一种有效治疗AD的手段。蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs)技术是一种快速有效的新型靶蛋白清除策略,然而其稳定性、半衰期和透血脑屏障效率亟待提高。本研究拟采用前期研究成功构建的类神经递质纳米载体实现对PROTACs负载制备成为PROTACs类神经递质载体,该研究将对PROTACs类神经递质载体的纳米表征、体内外靶向清除tau蛋白活性和抗AD活性进行系统探讨,旨在为PROTACs类神经递质载体作为新型抗AD药物开发应用增加理论依据。【方法与结果】首先通过化学合成PROTACs并进行纯化,然后利用氢谱分析鉴定PROTACs的分子。利用微量注射泵和旋转蒸发仪等仪器完成药物的制备,然后利用马尔文光散射仪、酶标仪等对纳米粒子的形态、粒径、电位、包封率、载药量、稳定性、体外药物释放等进行表征分析;通过CCK-8法考察PROTACs-NPs对N2a细胞(Neuro-2a细胞)的细胞毒性作用。结果表明,PROTACs-NPs纳米制剂粒径均一(粒径在200nm左右),分散性良好,同时具有medical group chat良好的储存稳定性和体内稳定性以及药物缓释特性;20μM浓度及以下的PROTACs-NPs对N2a细胞无明显毒副作用(细胞的存活率均>80%),为后续体内外实验中PROTACs-NPs的安全性提供了依据。接下来,将FAM标记的PROTACs-NPs(20μM)和FAM标记PROTAC(20μM)分别添加到孵育有N2a细胞的共聚焦皿中。培养不同的时间后,通过共焦显微镜观察在不同作用时间下细胞对纳米颗粒的摄取情况。为研究PROTACs-NPs纳米制剂诱导N2a细胞内tau蛋白的清除效果,然后利用不同浓度的PROTACs-NPs和PROTACs处理转染成功的N2a细胞一定的时间,通过流式细胞仪和Western Blot等方法,验证PROTACs-NPs在体外的清除tau蛋白能力。同时,还进行了免疫沉淀实验,研究Keap1和tau能否发生免疫共沉淀。结果表明,PROTACs-NPs纳米制剂可以显著提升N2a细胞对荧光素标记的PROTACs分子的摄取,提示纳米制剂在细胞层面的透膜性能较好。流式细胞仪和Western Blot等实验结果表明,与PROTACs治疗组相比,PROTACs-NPs治疗组的tau蛋白下调情况更加显著,高剂量组下降更明显,提示纳米制剂能显著提高PROTACs分子在体外的清除tau蛋白能力。此外,在PROTACs-NPs的作用下,Keap1和tau能发生免疫共沉淀。为了探讨PROTACs-NPs纳米制剂的体内靶向性和组织分布,选择Di R荧光染料作为PROTACs-NPs纳米制剂在体内的示踪剂。将小鼠分别经尾静脉注射负载Di R的NPs纳米制剂或者Di R/DMSO/PBS溶液,于2h后,将小鼠麻醉处死并取脑、心、肝、脾、肾等脏器,使用小动物活体成像仪观察离体脏器中的荧光分布。另外,用FAM荧光素标记的PROTACs分子制备PROTACs-NPs,经尾静脉注射至野生型成年小鼠体内,于2h后取出脑组织制作冰冻切片selleckchem BIBW2992,并在特殊显微镜下观察切片脑组织内荧光分布情况。结果表明Di R-NPs纳米制剂组的荧光强度普遍高于对照组(Di R-DMSO-PBS组),Di R-NPs纳米制剂能较为显著地在脑部富集并穿透。Di R-NPs纳米制剂组与对照组相比,脑内荧光强度提升约10倍左右。脑冰冻切片也具有相同的效果。为了探讨PROTACs-NPs纳米制剂的体内抗AD活性,选择12月龄的3×Tg AD模型小鼠(APP/PS1/tau三转基因小鼠)作为实验小鼠,小鼠每天通过尾静脉注射不同的药物(PBS、NPs、PROTACs和PROTACs-NPs),连续注射10天后,通过Morris水迷宫实验评估认知行为学功能变化。然后处死小鼠并提取脑组织,制作成脑匀浆和脑病理切片后,通过Western Blot和免疫荧光染色实验评估PROTACs-NPs纳米制剂对tau蛋白的清除效率。认知行为学实验结果显示,相对于PBS组和NPs组,PROTACs-NPs组的小鼠痴呆症状明显改善,而PROTACs组小鼠痴呆症状有一定程度的改善,但改善程度不及PROTACs-NPs组明显。脑组织切片免疫荧光染色及Western Blot实验,结果显示与其他组相比,PROTACs-NPs组的tau蛋白下降显著。最后,对PROTACs-NPs纳米制剂的体内生物相容性与安全性问题进行了探讨。在药物治疗期间,定期测量各组小鼠体重变化情况。在药物治疗结束后,通过检selleck合成测并分析各治疗组小鼠的血液中肝肾功能等指标的差异情况,以评估PROTACs-NPs在体内是否存在肝肾毒性。在药物治疗结束后,解剖收集各组小鼠的重要器官(如脑、心、肝、脾、肺、肾等),并称量、计算并比较各组小鼠的脏器系数,然后将小鼠器官制作成病理切片并进行苏木精&伊红染色(HE染色),观察PROTACs-NPs治疗组的病理切片是否存在形态学改变或者炎性损伤等。结果显示,脏器系数和肝肾功能在PBS、NPs、PROTACs和PROTACs-NPs各组之间没有观察到显著变化。器官的病理检查,与生化结果一致,未观察到明显的病理变化。【结论】综上所述,本研究证实PROTACs-NPs纳米粒子具有良好的粒径大小及均一性和稳定性;PROTACs-NPs纳米粒子在体内、外均能够有效地诱导细胞内过表达的tau蛋白清除;NPs作为纳米载体有效地发挥了靶向细胞和脑病变部位的纳米递送系统的作用,确保了PROTAC分子在体内实现治疗AD的效果;PROTACs-NPs纳米粒子在体内具有良好的生物相容性。