猪养殖业是我国畜牧业中的重要产业,仔猪断奶后腹泻(PWD)的高发病率和死亡率给养猪业带来巨大经济损失。引起PWD的因素复杂多样,但均与肠道微生物群失衡有关。此外,人类肠道菌群宏基因组目录中的功能性通路中有96%同样存在于猪肠道微生物组基因目录中。因此,猪肠道微生物引起了广泛关注。近年来,病毒宏基因组学研究揭示了人类肠道环境中的病毒群落,属于原核病毒的噬菌体占主导地位,并在维持人体健康状态方面发挥着重要作用。然而,断奶仔猪肠道微生物及其与腹泻相关性的研究主要集中在细菌组分上,尚未发现关于断奶仔猪肠道噬菌体组的研究报道。由于噬菌体及其编码的裂解酶基因被认为是一种有前途的抗生素替代物,因此,猪肠道噬菌体组可能是一个潜在的生物制剂库。此外,由于抗生素在猪养殖过程中的广泛使用,猪养殖业被认为是抗生素抗性基因(ARGs)潜在传播热点之一。噬菌体作为一种重要的可移动转移元件,可通过溶原转化或水平基因转移促进ARGs在细菌群落中的传播。然而,断奶仔猪肠道噬菌体相关ARGs的分布及其转导的途径和驱动因素未知。综上,揭示断奶仔猪肠道噬菌体群落,探索肠道噬菌体及其与腹泻以及ARGs之间的关系具有重要意义。本课题选用断奶仔猪应激性腹泻自然病例,通过对仔猪粪便评分和肠道组织病理观察鉴定选择健康和腹泻断奶仔猪,收集各仔猪回肠(小肠)内容物,盲肠(大肠)内D-Lin-MC3-DMA容物和新鲜粪便(直肠内容物)作为研究样本,分别提取样本中总DNA和病毒DNA进行宏基因组测序,取得以下研究结果:首先,对所有仔猪肠道病毒组测序结果进行了分析,共鉴定出50,756条病毒序列,其中高达99.88%的病毒序列与NCBI-NT病毒数据库中的病毒序列不匹配,表明了仔猪肠道病毒组序列的高度新颖性。注释的肠道病毒主要由有尾噬菌体目(Caudovirales)和微小噬菌体科(Microviridae)以及Smacoviridae病毒群组成。对不同样本中病毒及其功能基因丰度和多样性进行分析,结果表明健康仔猪回肠,盲肠和粪便样本中病毒群丰富度和多样性具有显著差异。相比之下,腹泻改变了仔猪不同肠道样本中病毒群的分布和多样性。第二,对健康和腹泻断奶仔猪肠道噬菌体及其与肠道菌群的关系进行了分析。结果显示健康和腹泻仔猪肠道Microviridae病毒群丰度显著高于Caudovirales(P<0.01)。与健康仔猪相比,腹泻仔猪样本(尤其是粪便)中的Caudovirales病毒群丰度增加。健康仔猪回肠、盲肠和粪便样本中噬菌体群落组成及物种多样性具有极大差异,腹泻导致这三个肠道部位噬菌体物种多样性发生改变,且群落结构趋于更高的相似性。此外,仔猪肠道菌群与肠道噬菌体病毒群发生平行变化。然而,噬菌体丰富度和多样性与菌群丰富度和多样性在仔猪健康和腹泻状态下呈显着反相关关系(P<0.05)。其中显著相关的噬菌体群落主要体现在Caudovirales病毒群,而具有显著性medical biotechnology关系的细菌类群包括普雷沃氏菌科、乳酸杆菌科、梭菌科、毛螺菌科、瘤胃球菌科、链球菌科、肠杆菌科以及拟杆菌科,这表明腹泻仔猪肠道噬菌体与细菌群落相关性的改变仅限于特定分类群。噬菌体-宿主预测结果表明,丰度较高的噬菌体匹配的宿主主要是一些常见病原菌属,且腹泻引起这些噬菌体丰度在不同肠道部位发生变化。在仔猪肠道菌群测序结果中,这些菌属的相对丰度与对应的噬菌体发生了一致的变化。此外,与健康仔猪相比,腹泻仔猪粪便中多价噬菌体物种多样性显著更高(P<0.05),匹配的宿主细菌种类趋向与常见致病菌,例如弯曲杆菌属、链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、肺炎克雷伯氏菌属和沙门氏菌属,其中弯曲杆菌和沙门氏菌是常见腹泻致病菌。总之,这些结果表明,断奶仔猪腹泻与肠道噬菌体有关,噬菌体在维持仔猪肠道生态健康方面扮演着重要角色。第三,对仔猪肠道噬菌体相关ARGs进行了分析,并探索了噬菌体介导ARGs转移的潜在途径和驱动因素。通过与CARD数据库比对,从59,955个噬菌体基因中筛选出112个ARGs。这些噬菌体相关ARGs主要来自仔猪盲肠内容物,且腹泻仔猪粪便样本中噬菌体相关ARGs的丰度显著(P<0.05)高于健康仔猪。根据Spearman相关性分析,11个ARGs分别与长尾噬菌体科、短尾噬菌体科、肌尾噬菌体科和微小噬菌体科噬菌体呈显著正相关。此外,通过比对和筛选,在59,955个噬菌体基因中发现303个可移动转移元件(MEG)同源基因。其中转座酶基因数量和相对丰度最高,其次是重组酶和整合酶基因。与噬菌体相关ARGs的分布特征一致,噬菌体相关MGEs基因主要来自盲肠样本,且腹泻仔猪粪便样品中MGEs基因丰度显著(P<0.05)高于健康仔猪。值得注意的是,共有18个噬菌体contigs(包括一个多价噬菌体contigs)同时携带ARGs和MGEs基因并均被注释为链球菌噬菌体,且这些ARGs和MGEs基因之间存在显著正相关,表明ARGs和MGEs基因在噬菌体中的共定位与特定的噬菌体宿主(链球菌)有关。重要的是,这些噬菌体基因组编码的ARGs序列片段与NCBI核苷酸数据中包括链球菌在内的多种细菌中的质粒、ICEs或转座子等多种移动元件的序列表现出高度共线性。此外,噬菌体相关ARG(ANT(9)-Ia)体外表达菌株对抗生素表现出了耐药性,证明了仔猪肠道噬菌体携带具有真正耐药性能的ARG。以上结果表明断奶仔猪肠道噬菌体组是ARGs重要储存库和可移动载体。噬菌体相关MGEs基因是影响ARGs维持和转移的重要因素。此外,腹泻导致仔猪粪便中携带ARGs和MGEs基因的噬菌体丰度显著增加,多价噬菌体(具有广泛宿主范围的噬菌体)多样性同时显著增加,这将有助于ARGs在细菌群落中的转染和更广泛的分布。值得注意的是,腹泻粪便中多价噬菌体的预测宿主谱倾向于潜在的肠道致病菌属,这大大增加了肠道病原体获得ARGs的风险。最后,从断奶仔猪肠道病毒预测基因中共筛选出75个噬菌体裂解酶基因。基于已鉴定的多价噬菌体序列,从中筛选出1个序列新颖且预测为链球菌噬菌体裂解酶(Lys33795)基因。将裂解酶基因序列合成后,成功完成载体构建与目的蛋白表达,对该裂解酶裂解谱、p H稳定性、温度稳定性、体外杀菌活性及生物膜清除能力进行了测定。结果表明裂解酶Lys33795具有广泛的裂解谱,不仅对猪链球菌有裂解活性,而且靶向裂解无乳链球菌、马链球菌兽疫亚种以及马链球菌马亚种。重要的是,Lys33Ipatasertib溶解度795对多重耐药猪链球菌表现出高效的杀菌活性,且不易诱导菌株抗性的产生。此外,Lys33795可在较宽p H值(p H值=3～10)和温度(4～45°C)范围内保持其裂解活性,且可以显著清除猪链球菌及马链球菌培养72 h形成的成熟生物膜。这些结果均有助于Lys33795成为应对多重耐药猪链球菌感染的后备临床药物。总之,本研究极大地扩展和丰富了人们对断奶仔猪肠道病毒组(特别是噬菌体组)的认识,为进一步揭示仔猪肠道噬菌体组在正常与腹泻状态下的演替规律提供了参考,为猪场ARGs污染的预防和控制提供了依据,为仔猪肠道疾病的微生态防控以及多重耐药细菌新型噬菌体及其抗菌蛋白的挖掘提供了新的思路。