目的:青蒿素类药物(artemisinin drugs,ARTs)被世卫组织推荐为抗疟的一线药物,然而随着广泛使用,在部分地区出现了对ARTs耐药的恶性疟原虫株,导致其药效下降。有研究发现,恶性疟原虫株Pfkelch13基因突变导致编码的kelch13蛋白突变与青蒿素类药物耐药直接相关。Pf K13蛋白突变导致Pf K13蛋白与疟原虫磷脂酰肌醇3-激酶(PfPI3K)结合力下降,PfPI3K泛素化降解减少,PfPI3K水平升高继而介导磷脂酰肌醇-3-磷酸(Phosphatidylinositol 3-phosphate,PI3P)过量。PfPI3K与PI3P抑制了血红蛋白向疟原虫的转运,使疟原虫环状体期发育停滞,对ARTs敏感性下降,另外,血红蛋白内吞减少使得亚铁血红素含量降低,ARTs活化受阻,导致其耐药性的出现,疗效下降。PfPI3K和人类PI3K的蛋白序列高度同源,尤其与Ⅲ型PI3K的结构更为相似,3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)作为一种广谱的PI3K抑制剂,可通过抑制P13K/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路,下调PI3K的表达,鉴于PfPI3K和人类PI3K的蛋白序列高度同源,利用3-MA的抑制作用有望逆转ARTs的耐药性。双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)作为广泛使用的抗疟一线药物,同样受到耐药性困扰,为了解决恶性疟原虫对ARTs的耐药性,提高ARTs的抗疟疗效,拟将二者联合用药。首先构建了伯氏疟原虫K173抗性虫株动物模型,并对其进行抗性诱导,而后将两者单独给药得到各自ED_(50)并进行联合给药,得到其联合用药指数。二者呈现协同给药,后续拟设计DHA与3-MA前药,由于DHA羟基不易与3-MA氨基反应,但是DHA前药青蒿琥酯(artesunate,AS)有羧基,容易发生酰胺化反应,以AS为原料药,通过与3-MA酰胺化反应得到DHA-3-MA的前药AS-3-MA(artesunate-3-Methyladenine,AS-3-MA)。恶性疟原虫在感染红细胞后,会在红细胞膜表面表达恶性疟原虫红细胞膜蛋白-1(Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1,Pf EMP-1),肝素能够与之特异性结合,为提高后续制剂对恶性疟原虫感染红细胞的靶向性,我们在此利用肝素修饰纳米脂质体以提高其靶向性。首先制备了双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体(artesunate-3-methyladenine nanoliposomes,AMLs)及肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体(heparin-modified artesunate-3-methyladenine nanoliposomes,HAMLs),并对HAMLs进行了处方优化。并考察了HAMLs制剂学特性、抗吞噬、体外靶向性、长循环等,为其后续用于抗疟治疗提供了基础依据。方法:1.DHA与3-MA协同给药评价首先构建了伯氏疟原虫K173抗性虫株动物模型,并通过动物模型对其进行抗性诱导,在诱导到十代后检测抗性指数呈中度抗性。然后构建了伯氏疟原虫K173抗性虫株动物模型,并将DHA与3-MA单独给药得到,各自的ED_(50)值。依据得到的ED值,设置二者以等摩尔比方式给药及等ED_(50)给药两种方式下的给药剂量,二者按照等摩尔比给药时的剂量为:(0.55、1.1、2.2、4.4、8.8)μmol/kg;按照等ED_(50)给药时的剂量分别为:1/4 ED_(50)、1/2 ED_(50)、E D_(50)、2E D_(50)、4 ED_(50)。利用动物模型,根据给药剂量及停药后的抑制率得到二者协同作用指数(combination index,CI)。2.AS-3-MA的合成以AS与3-MA为原料药,2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)为缩合剂,N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)为质子清除剂,通过酰胺化反应合成AS-3-MA。后采用傅里叶红外光谱(FT-IR)、高分辨质谱(HR-MS)、核磁共振氢谱(~1H-NMR)、碳谱(~(13)C-NMR)对其结构进行了鉴定。3.双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及制剂学特性采用薄膜分散法制备AMLs,以粒径(Size)、多分散指数(PDI)为考察指标,进行单因素优化后进行了响应面优化,得到AMLs较优处方。采用傅里叶红外光谱(FT-IR)对AMLs进行了表征,然后考察了AMLs稀释稳定性、血清中物理稳定性、储存稳定性及体外释放。4.肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及制剂学考察采用薄膜分散法制备得到包载胆碱衍生物与AS-3-MA的纳米脂质体,而后将其与肝素钠溶液在室温下共孵育24 h,通过离心除去游离的肝素钠,得到HAMLs。通过透射电镜观察了其形貌;利用马尔文粒度仪测定了HAMLs的Size、PDI及Zeta电位;考察了其稀释稳定性、血清中物理稳定性;用透析法考察了AMLs与HAMLs的体外释放;进行了HAMLs的体外溶血性试验。5.肝素修饰的纳米脂质体的体外靶向性、抗吞噬及长循环考察用香豆素-6(coumarin 6,C6)代替AS-3-MA,通过薄膜分散法制备包载C6的荧光纳米脂质体C6Ls(coumarin 6 nanoliposomes,C6Ls)及载胆碱衍生物与C6的荧光纳米脂质体,将后者与肝素钠溶液共孵育,通过静电吸附作用结合得到肝素修饰的荧光纳米脂质体(heparin-modified choline derivative/coumarin 6 nanoliposomes,HC6Ls);将HC6Ls与伯氏疟原虫K173抗性虫株感染的红细胞共孵育,高内涵成像系统分析肝素修饰的荧光纳米脂质体对被感染红细胞的靶向作用;体外培养RAW264.7细胞对HC6Ls的体外抗吞噬进行考察,高内涵成像系统观察其抗吞噬情况;使用C6作为荧光标记物,制备了肝素修饰的荧光纳米脂质体HC6Ls,这种纳米脂质体可以通过C6的荧光信号被追踪和检测。正常C57小鼠尾静脉注射HC6Ls 0.15m L,采取不同时间点采集血液样本的策略,并利用酶标仪测量各孔的荧光强度。通过这种方法,跟踪纳米脂质体Antigen-specific immunotherapy的代谢情况,评估其在体内的停留时间和稳定性,以考察其长循环。6.肝素修饰的纳米脂质体的抗疟药效利用前期经过抗性诱导后的伯氏疟原虫K173抗性虫株构建C57疟鼠模型,尾静脉注射不同剂量的AS-3-MA溶液、估计剂量的DHA溶液(8.8μmol/kg)、AMLs及HAMLs纳米脂质体,采用皮尔逊四天抑制法连续给药四天,于停药第四天,小鼠尾尖取血、甲醇固定、涂片、染色镜检,计算小鼠体内的疟原虫感染率与抑制百分比,得到AMLs与HAMLs的ED_(50)值;并持续考察疟鼠组、AMLs组与HAMLs组在35天内各组鼠的存活只数,记录并绘制生存曲线。于停药第15天,采集了正常鼠、疟鼠组、DHA溶液组、AMLs组与HAMLs组小鼠的肝、脾、肺、肾组织,石蜡包埋切片而后H&E染色,进行组织病理分析后,初步评价制剂的安全性。结果:1.DHA与3-MA协同抗疟作用利用诱导后的伯氏疟原虫K173抗性虫株构建C57疟鼠模型,给与DHA与3-MA单独治疗,得到二者的ED_(50)值,分别为:(2.71±0.06)μmol/kg、(83.61±1.36)μmol/kg。按照等摩尔比方式给药,剂量由低到高(0.55、1.1、2.2、4.4、8.8)μmol/kg,DHA与3-MA对疟鼠的抑制率分别为:35.6%、49.0%、70.0%、86.5%、94.0%,二者的协同作用指数分别为:0.68、0.87、0.85、0.86、0.74,呈现出较弱的协同作用;按照等ED_(50)方式给药,剂量按照1/4 ED_(50)、1/2 ED_(50)、ED_(50)、2 ED_(50)、4ED_(50)由低到高,二者联合给药对疟鼠的抑制率分别为:47.1%、60.0%、74.0%、85.3%、94.8%,协同作用指数分别为:0.57、0.73、0.78、0.84、0.58表现出协同作用,为后续试验提供了基础。2.AS-3-MA的合成傅里叶红外光谱图中,1720 cm~(-1)的吸收峰表示羰基上的N-H基团的伸缩振动,2928 cm~(-1)处的吸收峰表示酰胺键上的N-H基团的伸缩振动,而1253 cm~(-1)处的吸收峰表示酰胺键上的C-N键的伸缩振动;HR-MS测量得到的精确质量数与理论值的相对误差在一个数量级内;核磁共振氢谱~1H-NMR和碳谱~(13)C-NMR的谱图结果与所期望的化合物结构一致。综合表明成功合成了AS-3-MA。酰胺化反应合成AS-3-MA的产率较低,不足10%,合成工艺有待优化。3.双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及制剂学特性成功建立了AS-3-MA的HPLC方法,用于AS-3-MA含量测定及体外分析。在8.0～600μg/m L的浓度范围内,AS-3-MA线性良好;其检测限为4μg/m L,定量限为8μg/m L;所建立的方法精密度与专属性及回收率均符合方法学要求。通过单因素优化及响应面优化法,得到脂质体的较优处方,在该处方下制备得到的AMLs Size为(75.95±0.78)nm,PDI为0.30±0.02,粒径分布较为均匀,Zeta电位为(-21.63±1.59)m V,其绝对值较高,所测得的AMLs包封率为(80±0.03)%,制备的纳米脂质体混悬液显淡蓝色乳光。红外图谱中,AMLs冻干粉末在1720 cm~(-1)有羰基上N-H基团的伸缩振动峰,在2928 cm~(-1)处有酰胺键上N-H的伸缩振动峰,另有m PEG-PLGA、大豆磷脂、胆固醇特征峰,无新的峰形出现,显示脂质体成功制备。在稀释稳定性考察中,将AMLs在室温下利用超纯水稀释数倍后,测定其Size与PDI的变化,发现未发生较大改变,表明其具有较好的稀释稳定性;在血清稳定性试验中,将AMLs与胎牛血清共孵育24 h,于不同时间点测定混悬液吸光度,发现其未发生显著变化,表明AMLs具有较好的血清稳定性;将AMLs在4℃在储存,于第1、3、5、7、9天测定其Size与PDI,发现其未发生显著变化,表明AMLs具有较好的储存稳定性;在体外释放试验中,发现与AS-3-MA溶液相比,AMLs在48 h有44.59%释放,而AS-3-MA溶液则释放了接近75%,表明AMLs有缓慢释药的特性。4.肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及制剂学考察通过静电吸附作用制备得到肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体HAMLs,其Size为(86.95±0.40)nm,电位为(-24.60±0.25)m V,PDI为0.29±0.00,所制备的纳米脂质体具有较大的电位绝对值,较小的PDI,呈现淡蓝色乳光,透亮均一;对处方中的胆碱衍EPZ-6438生物与肝素钠比例进行优化,得到较优处方测得粒径为(82.00±0.89)nm,Zeta电位为(-24.00±0.55)m V。在100倍的稀释范围内内,经超纯水稀释后,HAMLs Size与PDI未发生显著变化,表明其具有较好的稀释稳定性;将HAMLs与胎牛血清共孵育24 h,其吸光度未发生显著变化,表明该纳米脂质体在血清中具有较好的物理稳定性;考察HAMLs在4℃环境下储存9天内稳定性,其粒径与PDI未发生显著变化,具有较好的储存稳定性;不同浓度的HAMLs与红细胞悬浮液进行孵育离心后,HAMLs均没有表现出明显的溶血现象,通过紫外分光光度仪测定吸光度,各浓度下HAMLs溶血率均小于5%,说明HAMLs具有较好的血液相容性和安全性。5.肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤纳米脂质体的体外靶向性、抗吞噬及长循环考察两种荧光纳米脂质体C6Ls与HC6Ls外观均一透明,带有浅黄绿色荧光,C6Ls Size为(83.52±0.82)nm,PDI为0.27±0.04;HC6Ls Size为(92.22±2.23)nm,PDI为0.26±0.01,两种纳米脂质体的Zeta电位分别为(-25.33±1.19)m V、(-17.00±0.40)m V,两种脂质体的包封率分别为(86.LBH589研究购买03±1.03)%、(72.97±0.91)%。C6Ls与HC6Ls 9 h的累积释放率分别为(32.18±0.44)%、(23.90±0.26)%,两种纳米脂质体的累计释放率均小于35%,而C6溶液9 h内透过透析袋的累计释放率为(52.53±0.99)%,表明C6成功包封于纳米脂质体中,可以用于后续试验。高内涵成像系统考察HC6Ls的体外靶向性,结果显示,正常红细胞基本无C6信号,但是受感染的红细胞内可以观察较强荧光信号,说明经过肝素修饰的纳米脂质体具有对受感染的红细胞的靶向亲和作用。高内涵成像系统观察小鼠单核巨噬细胞RAW264.7对两种荧光纳米脂质体的摄取情况,结果显示,HC6Ls相较于C6Ls,巨噬细胞对其吞噬大大减少,表明肝素修饰的纳米脂质体可以有效逃逸其吞噬。对制备的HC6Ls进行体内长循环考察,得到HC6Ls在正常C57小鼠体内半衰期为(36.71±2.97)h,高于C6Ls,表明肝素修饰后的纳米脂质体较未经修饰的纳米脂质体具有长循环作用。6.肝素修饰的纳米脂质体的抗疟药效在伯氏疟原虫K173抗性虫株构建的动物模型中,各治疗组中,均观察到疟鼠的感染率呈现出随着给药剂量增加而降低的趋势。在相同剂量下,HAMLs组疟鼠感染率均要低于AMLs组以及AS-3-MA溶液组。以停药第4天的感染率,测得AMLs与HAMLs的ED_(50)值分别为:(1.69±0.22)μmol/kg,(1.06±0.12)μmol/kg,低于DHA单独给药的ED_(50)值:(2.71±0.06)μmol/kg。通过后续小鼠生存状况考察,发现同等剂量下HAMLs治疗的小鼠存活天数普遍多于AMLs组与AS-3-MA组,在第30天的观察期,AMLs最高剂量组疟鼠存活1/2,HAMLs最高剂量组疟鼠全都存活,但是鼠体质均已特别弱,表明HAMLs具有较好的抗疟效果。停药第15天,取正常鼠、疟鼠、DHA溶液组、AMLs组及HAMLs组小鼠肝、脾、肺、肾石蜡包埋切片并进行H&E染色病理分析,发现由于取材时间较晚,各治疗组鼠均可看到有病理损伤,疟色素沉积、炎症细胞浸润等,相比其他组,HAMLs组病理损伤较轻,总体来看,其在体内应用是安全的。结论:1.DHA与3-MA协同作用评价利用构建的伯氏疟原虫K173抗性虫株疟鼠模型,在单独给药得到各自ED_(50)基础上,设置剂量,采用两种方式给药,以停药第一天的感染率计算得到二者联合给药协同作用指数,发现CI均小于1,二者表现出协同作用。2.AS-3-MA的合成通过酰胺化反应合成AS-3-MA,并通过FT-IR、HR-MS、~1H-NMR、~(13)C-NMR多种手段对结构进行确证,显示成功合成了该前药。3.肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体的制备及质量表征肝素修饰的双氢青蒿素-3-甲基腺嘌呤前药纳米脂质体呈球形,粒径均匀,无团聚现象,具有较好的稀释稳定性,与胎牛血清(37±0.5)℃孵育24 h,吸光度未发生明显变化,表明其在血清中具有较好的物理稳定性;在4℃环境下9天的储存时间内,其粒径与PDI未发生显著变化,表明其具有较好的初步储存稳定性体外释放实验中,观察到缓释特性,体外溶血实验中未观察或者检测到溶血现象,符合试验要求。4.肝素修饰的纳米脂质体的体外靶向性、抗吞噬及长循环考察肝素修饰的纳米脂质体可以逃逸巨噬细胞的吞噬,逃避机体免疫系统清除,具有抗吞噬特性;肝素修饰的荧光纳米脂质体较未经修饰的纳米脂质体在体内具有更长的表观消除半衰期,在体内滞留时间更久,具有长循环的特性;另外,肝素修饰的纳米脂质体对受感染的红细胞具有较好的亲和靶向作用,可以实现药物的靶向递送。5.肝素修饰的纳米脂质体的抗疟药效在构建的伯氏K173抗性虫株动物模型中,在同等剂量下,与AS-3-MA溶液组及AMLs组相比,停药第四天HAMLs组疟鼠感染率均低于AS-3-MA溶液组及AMLs组,在第30天的观察期,AMLs最高剂量组疟鼠存活1/2,HAMLs最高剂量组疟鼠全都存活,总之,HAMLs的抗疟活性优于AMLs与AS-3-MA溶液,H&E染色病理分析发现HAMLs组疟鼠病理损伤较其他组轻,总体来看HAMLs在体内应用是安全的。