以β-(2,6)糖苷键连接而成的levan-型果聚糖和以β-(2,1)糖苷键连接而成的菊糖是目前研究最多的两种果糖聚合物。由于其良好的理化性质和生理功能,β-(2,6)果聚糖被广泛用于各种领域。如在材料领域用于制作抗菌性纳米材料,在食品领域作为益生元、质构改良剂,在医药领域用于消炎和抗癌症助剂等。与菊粉不同,β-(2,6)果聚糖在自然界中存在较少,通过微生物酶法合成是目前β-(2,6)果聚糖最广泛的合成途径。其中,β-(2,6)果聚糖蔗糖酶(LS)是合成β-(2,6)果聚糖最主要的酶。本课题主要研究以下内容:(1)耐热型LS的定向挖掘及表达。结合Enzyme Miner筛酶网站和高温动力学计算模拟,得到来自微生物Cedritantimonas diazotrophica和Pseudomonas orientalis的具有潜在高热稳定性的LS。对所得序列进行序列一致性和进化亲缘性分析,证明两种酶均为潜在的LS。构建重组质粒并在大肠杆菌中进行重组酶的异源表达。使用镍柱亲和层析进行目的蛋白的纯化。(2)重组LS的酶学性质研究。C.diazotrophica和P.orientalis来源重组LS的最适温度均为65℃,其最适p H分别为5.5和6.5,比酶活分别为1003和1219 U/mg。其中C.diazotrophica LS在45℃下保温72小时后仍保留90%以上的相对活性,在55℃下的半衰期(t_(1/2))可达97 h,是目前已鉴定LS中热稳定性最高的。(3)重组LS的产物优化及鉴定。对重组LS的生产条件进行优化。结果表明,当蔗糖浓度为300 g/L,加酶量分别为20和25μg/m L时,C.diazotrophica和P.orientalis LS催化蔗糖生成levan的转化率可达到30.2%和29.2%,具有较高的levan合成效率。对两种重组LS的产物进行了分离纯化,成功得到高纯度的levan和低聚果糖(FOS)。对纯化后产物进行了NMR测定,证明其键型为β-(2,6)糖苷键。(4)温度对重组LS产物分布影响的探究。在65℃下,C.diazotrophica LS的反应产物中同时存在FOS、低分子量(4.1×10~4Da)和高分子量(HMW)levan(1.8×10~6Da)。而P.orientalis LS只合成FOS和HMW-levan(1.4×10~6Da)。LS通常在温度降低后倾向于合成levan,如C.diazotrophica LS。然而,P.orientalisDolutegravir临床试验 LS在反应温度降低后倾向于合成FOS而非levan。(5)基于结构分析的LS产物分布改造。以Bacillus subtilis来源LS的寡糖结合位点为基础,以ErwMedico-legal autopsyinia amylovora来源的LS为研究对象,通过基于结构的序列对比,得到E.amylovora LS中的对应氨基酸残基。在EAMG510采购.amylovora LS中对这些残基进行置换突变,以探究这些位置的残基对E.amylovora LS产物分布的影响。成功获得了一系列具有不同产物分布的突变体。其中位于loop1、loop3和loop4附近的突变体G98E、V151F和N200T所合成HMW-levan的分子量和产量都明显提高,表明其聚合能力明显提高。